肠毒素大肠杆菌定居因子CFA/Ⅰ和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA/I和CS6是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)中重要的两种优势抗原 ,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL0 1构成宿主 载体平衡致死系统。实验结果表明 ,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA/I和CS6抗原 ,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB/c小鼠后 ,可诱生相应的抗CFA/I和CS6的特异性血清抗体IgG和分泌型抗体sIgA ,说明以志贺氏菌为载体 ,可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗     

肠毒素大肠杆菌CS3定居因子抗原和融合肠毒素基因在减毒痢疾杆菌中的共表达

肠毒素和定居因子抗原 (CFAs)是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)两种主要的致病因素。有效的ETEC疫苗应包括这两种成分。采用基因重组技术 ,将定居因子CFA/II的共有抗原成分CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素基因克隆至以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因剔除的弗氏志贺氏菌Fwl0 1构成了宿主 载体平衡致死系统。结果表明 ,在无抗生素条件选择的情况下 ,该重组菌可稳定表达CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素抗原。通过口服和鼻饲方式免疫小鼠 ,可诱生相应的血清IgG抗体 ,同时能够检测到分泌型IgA的产生 ,表明该重组菌可以有效的诱导产生粘膜免疫。     

肠毒素大肠杆菌定居因子抗原基因CFA—1在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法,构建了包含asd基因的重组表达质粒pZHY21,与福氏志贺氏菌Fwl101构成了宿主－载体平衡致死系统,Westem印迹结果表明,在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CFA－I。电镜结果显示,在重组菌株的菌体表面,表达产物能够装配成菌毛。重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后,可以诱生CFA－I的抗体;同时可以检测到分泌型IgA产生,表明重组菌可以诱导相应的粘膜免疫反应。     

肠毒素大肠杆菌定居因子抗原基因CFA-I在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法 ,构建了包含asd基因的重组表达质粒 pZHY2 1,与福氏志贺氏菌Fwl0 1构成了宿主 载体平衡致死系统 ,Western印迹结果表明 ,在没有抗生素条件选择的情况下 ,稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CFA I。电镜结果显示 ,在重组菌株的菌体表面 ,表达产物能够装配成菌毛。重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后 ,可以诱生CFA I的抗体 ;同时可以检测到分泌型IgA产生 ,表明重组菌可以诱导相应的粘膜免疫反应     

肠毒素性大肠杆菌CS3纤毛抗原在痢疾菌中的表达及其免疫效果研究

首先通过体内外重组的方法,构建了福氏2a痢疾菌T32asd基因缺陷的突变体FaD,作为抗原载体菌;同时,构建包含asd基因的表达质粒pYX102,与FaD一起,构成宿主-载体平衡致死系统,用于在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达克隆在表达质粒上的外源抗原基因.将肠毒素性大肠杆菌的CS3菌毛抗原基因克隆至pYX102,构建成重组表达质粒pYX103,ELISA检测结果证实CS3在痢疾菌中可以很好地表达.免疫小鼠后可诱生相应的抗体,虽然口服免疫和注射免疫产生的CS3抗体效价有一定差别,但对痢疾菌的毒株攻击均可提供较好保护.该结果为细菌性腹泻疫苗的研制提供了候选株.     

表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6的一组基因的克隆

人源毒素源性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.Coil ETEC)是引起婴幼儿及旅游者腹泻的主要致病菌。ETEC的致病因子包括定居因子抗原 (Colonization factor antigens,CFAs)和肠毒素。大多数ETEC菌株均能产生抗原特异的菌毛,介导细菌与宿主小肠粘膜表面并在粘膜表面上受体的结合,使得细菌能定殖于粘膜表面并在粘膜的功能性清除中存活下来。已经报道的定居因子抗原包括CFA/Ⅰ,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅲ、CFA/Ⅳ(PCF8775)、PCF09和PCFO159等。CFA/Ⅰ和CFA/Ⅲ均由单一的菌毛亚基构成,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅳ则由多种表面抗原(colisurface antigen,CS)复合而成。所有的CFA/Ⅳ阳性菌株均表达CS6抗原,其中有些同时表达CS4或CS5抗原。CS4和CS5都是直径6～7nm的菌毛,能引起人和牛血红细胞的甘露糖抗性的凝集反应(MRHA)。迄今为止,没有观祭到CS6明显的菌毛结构,CS6也不能引起MRHA阳性反应。然而动物实验的结果表明,CS6是CFA/Ⅳ复合抗原中一种对定居作用最重要的抗原”,。本研究组已经通过分子克隆的手段获得了能分别表达CFA/Ⅰ和CS3抗原的重组菌株,用于人源ETEC疫苗的研究。本文报道了表达CS6菌毛抗原的DNA片段的克隆,并用免疫吸附制备的CS6抗血清测定了重组菌株表达的菌毛蛋白。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法,将asd基因插入重组表达质粒,使抗生素抗性失活,并与弗氏志贺氏菌FWL01构成宿主-载体平衡致死系统. 通过蛋白质印迹结果表明,在没有抗生素条件选择的情况下,可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6. 重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后,可以诱生CS6血清IgG抗体;同时可以检测到分泌型IgA产生,表明重组菌可以诱导相应的黏膜免疫反应.     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS3和肠毒素融合抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的共表达

不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）是产肠毒素大肠杆菌的主要致病因素,CS3为该菌的优势定居因子,是定居因子CFA/Ⅱ菌毛抗原的共有抗原组分。采用基因操作技术将编码CS3和融合肠毒素蛋白基因转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗侯选株X4072中进行表达。用重组菌株口服免疫小鼠后,免疫动物能产生抗CS3、LT和ST的血清抗体。特别有意义的是,所产生的抗ST抗体能中和天然ST的生物活性。这一结果为研究载体疫苗防治肠毒素大肠杆菌腹泻疾病奠定了基础。     

肠毒素性大肠杆菌CS6菌毛抗原与霍乱毒素B亚基在痢疾菌中的表达及其免疫学效果

构建了携带asd、霍乱毒素B亚基(CTB)基因的表达质粒pYX201,与福氏2a痢疾菌T32的△asd突变株FaD构成宿主质粒平衡致死系统,用于在没有抗生素选择压力的情况下,稳定表达CTB抗原基因。以此为基础,构建了单独表达肠毒素性大肠杆菌CS26菌毛抗原基因的重组质粒pYX202,以及同时表达CS6和CTB的共表达质粒pYX203。Western blotting和ELISA检测结果证实CS6及CTB在痢疾菌FaD中可以有效表达。重组菌免疫家兔后可诱生相应的血清抗体,特别是CTB的抗体效价较高,并持续较长时间。本研究为细菌性腹泻疫苗的研究提供了候选株。     

毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因的克隆

通过构建人源毒素源性大肠杆菌野生株E519/66A大质粒的基因文库,成功地筛选出能表达定居因子抗原CS6菌毛的阳性克隆,初步确定了克隆DNA片段的限制性内切酶图谱。CS6抗原的编码和调控基因集中在一大小为4.6kb的DNA区段中,该片段能产生两种分子量大小不同、但抗原反应交叉的菌毛蛋白。本研究获得的CS6抗原阳性的重组菌株可用于人源ETEC多价疫苗的研制,克隆的基因片段亦可作为研究CS6菌毛蛋白基因表达及调控的基础。     

利用宿主-载体平衡致死系统构建志贺氏菌3价疫苗候选株

选择福氏2a志贺氏菌疫苗株T32为受体菌,通过基因同源重组交换技术,对其染色体asd基因进行定位突变,使之不能在LB培基上生长;同时利用链球菌asd基因构建Asd⁺的无抗药性互补载体,两者组成1套T32宿主载体平衡致死系统.进一步应用该系统克隆和表达了具有重要免疫保护功能的宋内I相O抗原基因和志贺氏毒素B亚单位基因(stxB),构建成福氏2a-宋内-StxB3价菌苗候选株FSD0l.结果显示:该菌株遗传稳定,重组质粒不需用抗生素选择,能有效表达3价抗原和产生针对上述3种野生型毒株的免疫保护反应.     

表达大肠杆菌LT—B抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

采用无毒的鼠伤寒沙门氏菌sR一1l△Cya,△Crp,△asd菌株作为宿主菌,选择相应的asd+表达载体构建了含大肠杆菌肠毒素B亚基基因(toxB)的重组质粒,并通过两次转化引入宿主菌,构成了平衡致死的重组体。特异性的测定表明,这种无抗药性的杂合菌株能较高水平地表达LT—B抗原,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗的研究基础。     

宋内I相抗原和霍乱CT—B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)l相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的CT—B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248．得重组质粒PMGLl05。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏茵X4072．构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死景统。一系列实验表明．该重组苗X4072(PMGLl05)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原．小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

产肠毒素大肠埃希菌CfaB亚单位的免疫原性分析

目的表达并纯化产肠毒素大肠埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）CFA／I定居因子的CfaB亚单位,分析其免疫原性。方法将不含信号肽序列的cfaB基因克隆到pQE一30上,构建重组质粒pQE-30-cfaB并转化EcoliM15,表达融合蛋白6xHis—CfaB,将表达的蛋白纯化和复性后免疫BALB／c小鼠,制备抗CfaB的抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果6×His—CfaB融合蛋白高效表达,相对分子质量为15．5kD,纯化复性后免疫小鼠所得抗血清效价为1：125000。结论成功构建了高效表达6×His-CfaB融合蛋白的重组质粒,表达的融合蛋白免疫小鼠后获得了高效价的抗血清,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6蛋白的纯化和抗体制备

将大肠杆菌E519／66A在CFA固体培养基上培养,收菌后经热水浴脱蛋白、硫酸铵分级盐析、超速离心及S-200柱纯化,获得了相对分子量约14600的高纯度CS6蛋白。用其免疫家兔,然后颈动脉采血。ELSIA法检测血清,测得效价为1：32000。Westem印迹证实CS6抗原蛋白可特异性结合抗CS6多克隆抗血清。本研究建立了分离纯化肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原蛋白的有效方法;获得了高纯度的野生型定居因子抗原CS6蛋白及相应的多克隆抗血清。对于进一步研究肠毒素大肠杆菌腹泻疫苗具有重要意义。     

宋内Ⅰ相抗原和霍乱CT-B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)I相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio choler-ae)的CT-B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248,得重组质粒PMGL105。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏菌X4072,构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死系统。一系列实验表明,该重组菌X4072(PMGL105)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原。小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

肠毒素源性定居因子CS6在减毒伤寒沙门氏菌中表达及免疫原性的研究

将编码肠毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因克隆至pXL670,转化asd基因突变的E.coli X6097,获得重组质粒pSS64,再将后者转化至减毒的△aroA、△aroC、△asd伤寒沙门氏菌,构建了无药物抗性且稳定的大肠杆菌和伤寒双价菌苗候选株。小鼠腹腔免疫和攻击实验表明,该菌株对伤寒沙门氏菌毒株的攻击具有良好的保护作用。家兔免疫实验证明,该菌株能产生抗CS6和伤寒菌Vi抗原的血清抗体。     

稳定、无抗药的痢疾福氏2a和宋内双价菌苗候选株的构建

通过体内外基因重组,将大肠杆菌粘附因子cs3基因定位整合到痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32菌染色体的asd基因内,使asd基因灭活;将来内O抗原基因克隆至无抗药性表达载体pXL378,获得重组质粒pXL390,将其转化asd-的T32受体菌,构建成福氏2a和宋内双价苗苗株FS01。实验表明:重组质粒pXL390在不带任何抗菌素基因的情况下,在asd-的T32受体菌内是稳定的。FS01株遗传稳定,能表达两种痢疾菌的PLS-O抗原,无明显毒性作用。动物试验表明,以FS01株皮下免疫的小鼠对福氏2a和宋内有毒株的腹腔攻击有100％的保护。     

临床试验评估口服肠毒原性大肠杆菌原型疫苗的安全和免疫原性

作者开发了一种新的抗肠毒原性大肠杆菌（ETEC）腹泻的口服疫苗,这种疫苗含有表达水平提高的ETEC定居因子（CFs）和重组蛋白（LCT-BA）,即大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位与霍乱毒素B亚单位的重组蛋白的灭活重组大肠杆菌。作者进行了随机、双盲有对照的I期临床试验,60名瑞典成人志愿者参与了此项研究,观察了这种原型疫苗的安全性和免疫原性,并与以往开发的口服ETEC疫苗的结果进行比较,以往开发的疫苗为口服ETEC疫苗,这种疫苗含有CTB和灭活的表达CFA／I的野生型ETEC菌株（参考疫苗）。志愿者分组接受2剂或者是原型疫苗或者是参考疫苗。原型疫苗以相同剂量或者以4倍的剂量（与参考疫苗相比）进行投递。     

肠毒素性大肠杆菌ＣＳ６菌毛抗原与霍乱毒素Ｂ亚基在痢疾菌中的表达及其免疫

构建了携带asd、霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）基因的表达质粒pYX201,与福氏２a痢疾菌Ｔ３２的△asd突变株ＦaD构成宿主－质粒平衡致死系统,用于在没有抗生素选择压力的情况下,稳定表达ＣＴＢ抗原基因,以此为基础,构建了单独表达肠毒素性大肠杆菌ＣＳ２６菌毛抗原基因的重组质粒pYX202,以及同时表达ＣＳ６和ＣＴＢ的共表达质pYX203.Western blotting和ＥＬＩＳＡ检测结果证实ＣＳ６及ＣＴＢ在痢疾菌FaD中可以有效达。重组菌免疫家兔后可诱生相应的血清抗体,特别是ＣＴＢ的抗体效价较高,并持续较长时间。长研究为细菌性腹泻疫苗的研究提供了候选株。