实验8 质粒DNA的提取

一、氯化铯超速离心提取法 1.在LB培养基(10克蛋白胨,5克酵母膏,10克氯化钠,15克琼脂粉,溶解于水后,用1N NaOH调节pH至中性,加水至1,000毫升,高压蒸汽灭菌)上划线接种含有待抽提的质粒的细菌。37℃培养过夜。如果质粒上带有抗性基因,则在培养基内加入相应的抗菌素,例如20微克氨苄青霉素/毫升,12.5—15微克四环素/毫升。 2.挑出单菌落接种在10毫升LB培养液(除不加琼脂粉外,成份与LB培养液相同)中,37℃培养过夜。     

DNA重组技术：Ⅲ.重组质粒在大肠杆菌中的转化

氯化钙法是用质粒DNA转化细菌细胞,尤其是大肠杆菌细胞最常使用的方法。实验操作如下: (1) 将受体菌接种在平板培养基上划线,37℃过夜,进行活化。 (2) 挑选单菌落,接于5ml LB培养液,37℃震荡过夜。 (3) 从上述培养液中取0.5ml,转入50mlLB培养液,37期震荡培养2～4小时,到细菌密度大约为5×10~7/ml,OD_(575)约为0.8。     

哺乳类基因工程的一些实验操作 实验10X噬菌体DNA 体外包装

一、需用的菌株及其特性鉴定 1.菌株及其基因型 (1）大肠杆菌E. coli BHB2688，基因型为：N205 rec＾一〔rimm"`9 clts, b2, red-, Earn, Sam/r.lo (2）大肠杆菌E. coli BHB 2690，基因型为： N205 recA- [rimm"9`. cIts, b2, red-. Dam, Sam/r]. (3）大肠杆菌E. coli K802，基因型为：hsdR+, hsdM+.} gal-, met-, SUPHO 2.鉴定clrs基因 (1) BHB 2688和BHB 2690各自接种在2只LB 培养基上。一只置32℃下培养，另一只置42℃下培 养。在32℃培养的平板上挑取单菌落，接种在LB培 养液中，32℃培养过夜。 (2）再将培养液中生长的细菌划线接种在2只 LB培养基上，分别置32℃和42℃下培养。如果细菌 只在32℃ 下生长，则可用于制备包装用的抽提物。 3.鉴定，cA基因 (1)在LB平板上，平行划线接种BHB 2688, BHB 2690和K802o (2）用厚纸遮住培养皿的一半，打开培养皿盖置 紫外线下照射。然后在犯℃下培养过夜。 (3）厚纸遮挡部分的培养基上，BHB2688和BHB 269。生长，紫外线照射的培养基上则不生长。K802 不受紫外线照射的影响都能够生长。     

硷茅的组织培养

植物名称:硷茅(Puccinellia chinamhoensic)。材料类别:两年生4～6叶期植株的茎段和叶片。培养条件:1.以MS为基本培养基。2.诱导愈伤组织培养基和分化培养基为(1)MS 2,4-D0.1mg/L(单位下同);(2)MS 2,4-D0.5。3.生根培养基为1/2MS IAA0.5。4.蔗糖3％,琼脂粉0.5％,pH5.8,培养温度25±2℃,每日光照10小时,光照度2000lx。生长与分化情况:剪取硷茅幼嫩的茎段和叶片,用2％安替福尼溶液消毒15分钟,再用无菌水漂洗3～4次,切取0.5cm左右的切段,接种在培养基(1)     

小金海棠子叶培养和植株再生

植物名称:小金海棠(molus xiaojinensis)材料类别:小金海棠的种子,用冷水浸泡吸胀,经0.1％升汞消毒15分钟后,无菌水冲洗干净,接种子琼脂培养基上,2～3周后发芽(发芽率只有20～30％左右),然后切取子叶进行离体培养。培养条件:每升MS基本培养基,附加6-BAI～2mg/L(单位下同),NAA0.1～0.2,LH100,肌醇100,蔗糖3％,琼脂粉0.5％,培养温度26±2℃,每天光照8～10小时,光照强度2000 lx。生长与分化情况:子叶接种子培养基上4～5周后,子叶长大变厚呈绿色,近轴面诱导出绿色芽点,逐渐分化成丛生芽,每片子叶可得3～10个绿色     

介绍一种培养衣藻的新方法

最近,我用琼脂培养基培养衣藻效果很好,其配方如下:硝酸钾1克、氯化钾0.25克、硫酸镁0.25克、磷酸氢二钾0.25克、1％的硫酸亚铁0.2毫升、水1000毫升。以上各盐类溶于1000毫升水中,再加10克琼脂,加热溶解后,倒入试管中(占1/4)高压(1.5kg/cm)灭菌40分钟,取出摆成斜面,自然冷却后在无菌条件下,用接种环将衣藻接种在斜     

从国内现有菌株制备磷酸转乙酰酶

磷酸转乙酰酶(PTA),最早由Stadtman用克氏梭状孢子杆菌制备,但菌体培养烦难。1967年和1970年,Abiko报道了由大肠杆菌B制备PTA,并用以测定辅酶A。我们在Abiko工作的基础上,用大肠杆菌1.505制备PTA,获得较好的结果。大肠杆菌1.505菌种,是由中国科学院微生物研究所提供的。菌体培养条件如下:斜面培养基的成分是:1％蛋白胨,0.5％氯化钠,2％琼脂加蒸馏水至1,000毫升,趁热用绢布或纱布过滤分装,121℃,15磅灭菌30分钟,在无菌操作下将大肠杆菌1.505-环接种到斜面培养基上,37℃培养15小时。种子培养基的成分是1％葡     

产生葡萄糖淀粉酶的红曲霉的筛选及其发酵条件的研究

筛选出了红曲霉 AS 3．976(Monascus serorubescens)和 AS 3.978(Monascus sp.)作为液体培养生产葡萄糖淀粉酶的优良菌种,并找出了适合的培养基及培养条件。在含玉米粉3％、豆饼粉1．5％(pH 4．5)的培养基申,于30--35℃培养72小时,每毫升培养液的滤液酶活力可达260单位。酶作用的最适温度为50℃,最适pH为4.5,每克干淀粉用酶量0.5毫升,糖化32％(w／w)的浓淀粉液化液,经40小时,葡萄糖值可达99以上。     

晚香玉块茎的离体培养

植物名称:晚香玉(Polianthes tuberosa) 材料类别:块茎培养条件:接种培养基为MS,蔗糖浓度3％,琼脂0.7％,pH调至6.0,其附加激素类物质有:(1)NAA 1mg/l(单位下同) ZT0.2;(2)NAA1 BAO.1;(3)BA1 NAA0.1;(4)BA1 KT1 NAA0.5。培养温度为25±2℃,每天光照10小时,光强为2支 40W日光灯。生长与分化情况:取块茎洗净后,切成0.6×0.6×0.4cm见方,接种在上述各种培养基上。经一个月培养后,在1号培养基上,光长数条根而已,却没有芽的分化;在2—4号培养基上,均有芽的分化,     

猕猴肝细胞的分离及培养

用浓度为50毫克/100毫升的胶原酶液,在体外无菌的条件下灌注分离猕猴肝组织块,所分离到的肝细胞活性率达88—91％。用含10％胎牛血清,0.2％牛血清白蛋白,1毫升/100毫升牛咦岛素的基础培养基(MEM),在37℃含5％CO_2:的培养箱中培养。细胞在塑料培养皿中贴壁伸展良好,培养一个月后,仍见有大量贴壁的肝细胞,它可满足弓形体的生长发育。     

深层培养法生产无毒炭疽芽孢苗

1．以2％蛋白胨水溶液为培养基,以无毒炭疽芽孢为菌种,连续深层培养2—5代作为种子,再经深层通气培养制成芽孢苗。接种后先在35—36℃连续通气培养8小时,然后自然降温在31—33℃继续培养16小时至收苗。通气置为1:3(V／V),24—28小时芽孢形成率一般可达80％以上。此芽孢可经受60℃30分钟热处理。 2. 深层培养所得芽孢苗安全试验,对家兔注射1毫升(每毫升含1．5—2．5×10,活芽孢),对绵羊注射10毫升后动物均健活;区域试验时,对绵羊注射0．5毫升,对马、牛、驴、骡注射1毫升亦安全。 3. 免疫力试验表明,兔可获得3/4以上的保护,对绵羊,有二批可保护100％,一批保护80％。 4．用30％甘油水溶液稀释成含10‘活芽孢的液体免疫绵羊,二批可抗强毒炭疽芽孢200个,对最小致死量强毒芽孢获100％保护;一批保护75％,与同体培养芽孢苗相似。 5. 室温或10—15℃保存一年至43个月,芽孢菌原液活芽孢死亡不显著,免疫原性稳定,免疫力强。     

用印片法制青霉和曲霉的永久封片

(一)材料和方法 1.菌种:青霉(Penicillium chrysogenum),黑曲霉(Aspergillus niger) 2.培养:将青霉和黑曲霉斜面制成悬液,吸0.1ml于马铃薯培养基(马铃薯200克,蔗糖20克,琼脂粉11克,水1000毫升,15磅/吋~2灭菌30分钟)平板上涂布,于28℃培养2天。 3.制片:取两块干净载玻片,在其中一块上涂一层薄胶层(胶为光学树脂),然后用解剖针在青霉或曲霉平板上挖一小块带菌琼脂(约0.5厘米~2),将琼脂块放在薄胶层上(培养面朝下),用另一块载玻片在琼脂块上轻轻按压,然后将琼脂块小心弃去。将印有菌迹的载玻片     

瓶栽蛹草子座的方法

蛹草(Cordyceps militaris),也称北冬虫夏草,其药性与传统中药材冬虫夏草(C.sinensis)相近。我们在罐头瓶内多次育成蛹草子座,现将方法介绍如下。 (一)培养基的制作与接种方法普通大米:高梁米=9:1,使含水量达到110-120％,其中含KH_2PO_40.1％,MgSO_4 0.05％,酵母粉0.5％,蛋白质少量。每瓶加入50-100克干重的培养基。灭菌时间:高压1.5-2小时,常压8-10小时。取斜面菌种一小片或米饭培养基菌种一小块,在无菌条件下接种在罐头瓶内。菌种特点:在斜面培养基上菌丝纯白色、粗壮浓密,紧贴培养基生长,边缘清楚;在米饭培养基上容易形成浅桔黄色的色素沉着。 (二)栽培管理菌株接种后,在15℃左右条件下培养。6-10℃生长缓慢,20-25℃有利于子座形成。培养基含水量低于100％以下,生长缓慢;湿度过     

‘凤丹白’牡丹不定芽的诱导和生根研究

将‘凤丹白’牡丹胚萌发形成的无菌苗接种于含不同植物生长调节剂组合的MS培养基,研究了不同植物生长调节剂组合对‘凤丹白’牡丹不定芽的诱导及生根率的影响.试验证明,在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖3％(W/V)+琼脂0.65％(W/V),pH5.8培养基上,‘凤丹白’牡丹胚萌发率可达100％.‘凤丹白’牡丹胚萌发2周后转接于不定芽诱导的培养基MS+6-BA 0.2 mg/L+GA3 0.02 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖3％(W/V)+琼脂0.6％(W/V),pH5.8上,不定芽诱导的频率最高为50％.培养30 d后,将其转接于生根培养基1/2MS+2Ca2++6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+硫酸锌0.005％(W/V)+硫酸锰0.005％(W/V)+蔗糖2.5％(W/V)+琼脂0.56％(W/V),pH5.8上,生根率达60％.     

束状刺盘孢的体外培养条件研究

目的对束状刺盘孢体外培养,观察形态特征。方法将束状刺盘孢接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中分别置于4℃、28℃、35℃和37℃下培养2周,观察生长情况;选取生长最好的菌株分别接种在沙堡弱培养基(SDA)、PDA、察氏培养基(CPA)、胡萝卜琼脂培养基(CDA)和玉米粉培养基(CMA)中,同一温度下培养2周,观察菌落形态及镜下形态。结果菌株在28℃条件下生长最快、菌落发育饱满、产生灰色色素;菌株在五种培养基中生长快慢依次是PDA>CDA>CMA>SDA>CPA,菌落在PDA、CDA和CMA中呈鼠灰色,SDA中呈白色和棕色,CPA中呈白色和鼠灰色,SDA和CPA中未见分生孢子和刚毛产生。结论在PDA、CDA和CMA中28℃条件下,较适合束状刺盘孢生长。     

地衣芽胞杆菌培养条件的研究

应用单因素和正交试验设计试验法对地衣芽胞杆菌在摇瓶水平上进行了培养基配方和培养条件的研究。结果表明：最适培养基配方为山芋淀粉1．0％,豆粕0．6％,玉米芯粉0．8％,K2HPO4 0．1％,MgSO40．1％。最适培养条件为37℃,摇床转速150r／min,250mL三角瓶装液50mL,接种量5．0％,振荡培养48h,pH7．0。在20L自动发酵罐中进行了扩大培养试验,考察溶氧对菌体生长的影响,并根据试验结果进一步扩大至1m^3发酵罐,通过控制搅拌速度和通气量,1m^3发酵罐中地衣芽胞杆菌培养液菌浓为7．2×10^9efu／mL,芽胞率达到90％。     

大瓶旋转培养地鼠肾细胞用于流行性乙型脑炎疫苗生产

地鼠肾组织经胰酶消化后,接种于盛有2000毫升含5％小牛血清的营养液的15升大瓶内,在旋转机上(4—5转／小时)37--38℃培养42—48小时,瓶壁周围即布满繁殖成致密单层的细胞。然后接种乙型脑炎病毒“P,”毒种,37—38℃静置培养36—48小时。当25—50％细胞圆缩,病变区明显和较多细胞脱落时收获,毒力log LD50 为5.0—6.5者占74％;log LD50为4.5一4.9者占26％。所制疫苗的ID50=10-3叫毫升以下者占84．6％。疫苗在8屯保存一年半,ID50没有降低。     

滇大头茶的组织培养和微型繁殖

1植物名称滇大头茶(Gordonia yunnanensis). 2材料类别嫩梢的尖茎和茎节切段. 3培养条件(1)芽萌动和生长培养基:MS 6-BA 1.0mg·L-1(单位下同) IAA 0.5;(2)多芽体诱导培养基:MS 6-BA 3.0 IAA 0.5;(3)壮苗培养基:MS ZT1.0～2.0 IAA 0.5或MS 10%椰子汁(CM) IAA 0.5;(4)生根培养基:1/2ER IBA 0.5;(5)纸桥生根培养液:1/2ER,用IBA0.5～1.0g·L-1浸芽条基部20min,将芽条接种滤纸桥上,然后置弱光(200 lx)下培养.培养基添加3%(生根用2%)蔗糖和0.6%琼脂,pH5.6.培养温度25～27℃,夜间18～22℃,光照时间14h·d-1,光照度1 500 lx.     

昆虫病毒重组质粒的快速提取

质粒的提取与纯化是基因工程的重要内容。我们用昆虫杆状病毒BsNPV DNA的Bam HI片段与质粒pBR322重组得到重组体pBSa18和pBSb36。用LB摇床培养。 质粒pBR322 DNA用Gonzalls等(1980)的常规法提取。重组质粒的提取是离心40ml培养液收获细胞,加pH7.8 4×TEA缓冲液50ml,GSE(甘油50％,SDS 5％,EDTA0.1M)18ml,70℃保温10分钟,-20℃冷冻过夜,次日在4℃离心12 000r/min15分钟,取上清直接进行制备性琼脂糖凝胶电     

牡丹根皮提取物对口腔细菌的作用

为了研究牡丹根皮提取物对口腔细菌的作用效果,首先用水蒸气蒸馏法提取牡丹韧皮部丹皮酚,并通过紫外分光光度计测定丹皮酚的浓度,配制含不同丹皮酚浓度梯度的牛肉膏、蛋白胨培养基,在无菌条件下分别接种口腔细菌,37℃恒温过夜培养,通过观察细菌在培养基上的生长情况得出丹皮酚对口腔细菌的作用效果。