转基因植物生产重组药物蛋白的研究进展

转基因植物作为一种新型生物反应器,可以安全、经济、有效的生产各种重组蛋白,以此作为大规模的重组药物生产平台备受瞩目。但是表达量低、下游处理复杂、糖基化结构改变是植物反应器中经常遇到的困难,这些困难限制了植物表达重组药物蛋白的商业化发展。针对这些问题,人们分别采用不同的生物技术策略加以解决,对此做一简要综述。     

聚乙二醇化重组蛋白药物的质量控制

重组蛋白经聚乙二醇(PEG)化修饰在优化药物代谢动力学和药效学性质的同时,使药物的结构和质量属性变得更为复杂,修饰后的重组蛋白在结构、理化性质和生物学活性等方面与未修饰的重组蛋白相比有较大差异,对其质量控制的研究必须结合品种自身独特的质量属性。现从蛋白质药物质量控制的角度,对PEG化蛋白质药物的重要质量属性的质控难点和相应检测方法进行综述,以期对工艺开发和生产上的实际工作有所帮助。     

植物细胞培养生产重组蛋白

用植物细胞培养生产重组蛋白,集合了微生物发酵的快速性、动物细胞培养产物的多样性和完整植株培养系统的安全性,近年来引起了广泛的关注。虽然还未有用植物细胞培养来进行重组蛋白的商业生产,但是它的生产原则较规范,下游处理过程较简单,具有潜在商业生产的可行性。     

昆虫杆状病毒载体的细胞培养和重组蛋白生产

利用杆状病毒载体和昆虫细胞生产重组蛋白的研究日益增多,本文就杆状病毒的宿主细胞种类、培养条件、大规模培养方法和虫体表达以及昆虫细胞对表达产物的翻译后修饰加工的研究现况进行了概述。     

大肠杆菌中重组GNA蛋白的分离纯化

具有特异结合甘露糖基的雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutnin,GNA)具有多种生物活性,在糖蛋白分离、逆转录病毒病和害虫防治等方面有广泛的应用价值。该试验分别采用超声破碎法、冻融裂解法和溶菌酶法破碎重组大肠杆菌细胞后,经尿素或SKL(十二烷基肌氨酸钠水溶液)溶解后,再透析复性获得了在大肠杆菌(E．coli)中高效表达的重组GNA蛋白,并经SDS—PAGE电泳检测GNA的大小、浓度及表达量．通过对诱导表达时间、超声处理的功率、时间、模式、尿素和SKL洗涤浓度,透析条件的优化组合,建立了一套从大肠杆菌细胞中分离重组GNA蛋白的有效方法,为进一步的重组CNA生物活性试验提供了物质基础,     

长效重组蛋白药物发展动态

部分重组蛋白药物存在半衰期短的缺陷,临床给药频率高,且大多为注射给药,严重影响患者使用依从性。长效重组蛋白药物是近年来生物技术药物发展的重要趋势之一。对蛋白分子进行改造或修饰,延长重组蛋白药物的半衰期,实现长效以减少给药频率主要通过4种方式:化学修饰、构建突变体、蛋白融合、糖基化修饰。针对上述4种长效化方式及已上市相关产品进行了综述。展望未来,紧跟国外先进技术和质量标准发展,进一步提高国产长效重组蛋白药物质量水平,推进国内相关产品标准升级,推动创新长效重组蛋白药物开发及专利布局是未来几年国内该领域的发展方向。     

长效重组蛋白药物的研究进展

重组蛋白药物经静脉和皮下注射后通常半衰期较短,目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物分子量;2、利用血浆药物平衡;3、减少免疫原性。本文针对构建突变体、PEG化修饰和与血清白蛋白融合三种延长重组蛋白药物半衰期的方法,及其已上市的和正在研发中的长效重组蛋白药物的特征、半衰期和免疫原性问题进行了综述。     

幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定

目的研究幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性。方法将PET32a-vacA-E.coli BE21（DE3）工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性。结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2240bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性。结论VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性。     

重组人ERP57蛋白克隆和原核表达

目的：克隆人ERP57蛋白进行原核表达和纯化。方法：采用巢式RT-PCR从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人ERP57 cDNA,构建ERP57原核表达质粒（pET-28a/ERP57）并转化E.coli的BL21菌株。IPTG诱导蛋白表达,并在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化。分别用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果：成功获得大小为1518bp的人ERP57基因片段,转化菌诱导性表达61kDa的人ERP57蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功获得纯化的重组人ERP57蛋白,为后续ERP57蛋白功能研究奠定了基础。     

黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质

漆酶是一种应用广泛的绿色环保的多酚氧化酶。漆酶过去被认为广泛存在于植物、昆虫和真菌中,而近年来,越来越多的细菌中也发现了漆酶的存在。黏细菌是一类重要的资源菌,但与一般细菌相比,较难分离和纯化。文中利用生物信息学的方法,综合应用Blast和隐马尔可夫模型方法对黏细菌蛋白质组数据库进行搜索,并根据多铜氧化酶的保守铜离子结合位点进行进一步筛选,获得30个候选黏细菌漆酶序列。挑选其中9个,在大肠杆菌中进行重组表达。利用2,6-甲氧基苯酚(DMP)等常用漆酶底物检测重组酶的催化氧化活性,其中7个重组蛋白具有漆酶催化活性。选择1个对2,6-甲氧基苯酚(DMP)具有较高氧化活性的重组酶(命名为rSC-2),通过Ni-NTA亲和层析柱纯化rSC-2,测试其酶学性质。纯化的rSC-2蛋白分子量约57 kDa,在最适反应条件下,rSC-2催化DMP反应的比酶活为0.27 U/mg。催化DMP反应的最适温度为60℃,最适pH为7.0。rSC-2在pH 7.0-8.0有较高酶活,在60℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低浓度的Ca~(2+)对酶活有一定的促进作用,而较高浓度的Fe~(3+)、Co~(2+)、Ba~(2+)对酶活的抑制作用较明显。这是首次对黏细菌漆酶序列进行系统性的生物信息学分析,并实现纤维堆囊菌Sorangium cellulosum序列来源的漆酶活性蛋白在大肠杆菌细胞中重组表达。     

High expression of a human lactoferrin in transgenic tobacco cell cultures

Transgenic Nicotiana tabacum cell lines were developed expressing the human lactoferrin gene driven by the oxidative stress-inducible peroxidase (SWPA2) promoter. Western blot analysis showed the accumulation of both the full-length human lactoferrin protein as well as a immuno-reactive truncated fragment. Accumulation of human lactoferrin as monitored by ELISA increased proportionally to cell growth and reached a maximal (up to 4.3% of total soluble proteins) at the stationary phase of growth. Protein extracts from transgenic tobacco cells exhibited antibacterial activity.     

Intrinsic glycosylation potentials of insect cell cultures and insect larvae

Summary The glycosylation and subsequent processing of native and recombinant glycoproteins expressed in established insect cell lines and insect larvae were compared. TheSpodoptera frugiperda (Sf21) andTrichoplusia ni (TN-368 and BTI-Tn-5B1-4) cell lines possessed several intrinsic glycoproteins that are modified with both N- and O-linked oligosaccharides. The N-linked oligosaccharides were identified as both the simple (high mannose) and complex (containing sialic acid) types. Similarly, theT. ni larvae also possessed intrinsic glycoproteins that were modified with O-linked and simple and complex N-linked oligosaccharides. Additionally, human placental, secreted alkaline phosphatase (SEAP) produced during replication of a recombinant baculovirus inT. ni larvae was modified with complex oligosaccharide having sialic acid linked α(2–6) to galactose.     

Expression, purification and anti-tumor activity of curcin

Curcin,purified from the seeds of Jatropha curcas,can be used as a cell-killing agent.Understanding the anti-tumor activity of the recombinant protein of curcin is important for its application inclinical medicine.The segment encoding the mature protein of curcin was inserted into Escherichia colistrain M 15,and the recombinant strain was induced to express by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside at aconcentration of 0.5 mM.The recombinant protein was expressed in the form of inclusion bodies andpurified by Ni-NTA affinity chromatography.The target protein was incubated with the tumor cells atdifferent concentrations for different times and the results demonstrated that the target protein could inhibitthe growth of tumor cells (NCL-H446,SGC-7901 and S180) at 5μg/ml.     

小鼠PC-1基因在大肠杆菌中的表达和纯化

利用PCR和基因重组技术构建了小嫌PC－1基因全长cDNA及其N端45个氨基酸残基的表达质粒pGEX-4T-1-mPC-1和pGEX-4T-1-mPC-1-45。经IPTG诱导后,在大肠杆菌DH5α中,GST－mPC-1和GST－mPC-1-45两个融合蛋白都获得了可溶性高表达。经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,获得了纯的GST－mPC-1和GST－mPC-1-45蛋白。     

人白细胞介素-11基因在家蚕培养细胞和虫体内的表达

将缺少编码信号肽序列的人白细胞介素－11（hIL-11)546核苷酸cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacIL-11,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒（BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hIL-11基因的重组病毒。Southern杂交表明重组病毒基因组中含有hIL-11基因片段,RNA斑点杂交表明hIL-11基因得到了转录。重组病毒感BmN细胞株、家蚕幼虫和蛹,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫和蛹的体液样品中,SDS－PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带;采用IL－11依赖细胞株B9－11和MTT法测定表达产物的生物活性,表明rIL-11基因分别在培养细胞和蚕体内得到了高效表达。