CRISPR/Cas核糖核蛋白介导的植物基因组编辑

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统作为一种重要的基因编辑工具,自诞生以来被广泛应用于作物的性状改良。与CRISPR/Cas DNA载体介导的植物基因组编辑相比,CRISPR/Cas核糖核蛋白(CRISPR/Cas ribonucleoprotein, CRISPR/Cas RNP)介导的植物基因组编辑具有作用迅速、脱靶率低和无外源DNA插入(DNA-free)等优点,因而无需清除CRISPR编辑工具而更容易获得纯合的编辑体。但是,由于植物细胞转化方法和细胞再生技术的限制,不借助筛选标记的辅助将CRISPR/CasRNP直接导入植物细胞并获得高效基因编辑仍比较困难,直接限制了CRISPR/CasRNP在植物基因组编辑中的广泛应用。本文系统介绍了CRISPR/Cas RNP基因组编辑技术的分子作用机理及其优势,并总结了CRISPR/Cas RNP导入植物细胞的方法,最后对CRISPR/Cas RNP在植物基因组编辑中的新应用和新思路进行了展望,以期为进一步改进CRISPR/Cas RNP基因组编辑技术和扩大其在作物改良中的应用提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在非模式植物中的应用进展

基因组编辑技术的出现对植物遗传育种及作物性状的改良产生了深远意义。CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是由成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白组成的免疫系统,其作用是原核生物(40%细菌和90%古细菌)用来抵抗外源遗传物质(噬菌体和病毒)的入侵。该技术实现了对基因组中多个靶基因同时进行编辑,与前两代基因编辑技术:锌指核酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酶(TALENs)相比更加简单、廉价、高效。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、番茄(tomato)等模式植物和多数大作物中实现了定点基因组编辑,其应用范围不断地向各类植物扩展。但与模式植物和一些大作物相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术在非模式植物,尤其在一些小作物的应用中存在如载体构建、靶点设计、脱靶检测、同源重组等问题有待进一步完善。该文对CRISPR/Cas9技术在非模式植物与小作物研究的最新研究进展进行了总结,讨论了该技术目前在非模式植物、小作物应用的局限性,在此基础上提出了相关改进策略,并对CRISPR/Cas9系统在非模式植物中的研究前景进行了展望。     

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。其中II型CRISPR/Cas系统已被改造成为一个简便、高效的基因编辑工具,并在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改良中得到广泛应用。简述了CRISPR/Cas系统的结构、作用机理及分类情况,归纳总结了CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母和其他丝状真菌中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行了展望,以期为真菌基因编辑研究提供参考。     

植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是植物基因功能研究与作物改良的有效工具.为此,本实验室开发了高效的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统.本载体系统包括6个双元载体和12个含有不同U3/U6启动子的sg RNA中间载体,可满足对单子叶和双子叶植物的遗传转化以及不同抗生素筛选的要求,具有简便、高效,可同时对多基因进行编辑的特点.此外,为了能更高效地应用基因组编辑技术,还开发了一站式在线分析工具包CRISPR-GE.为方便研究人员利用CRISPR/Cas9系统进行植物基因组编辑,本文提供了从靶点选择、CRISPR/Cas9多靶点双元载体构建,以及对靶点突变序列的测序分析等详细的操作方法,以及常见的问题解答.     

基因编辑新技术最新进展

借助基因编辑技术精准编辑植物基因组,得到性状优良、产量高的农作物种质是目前作物分子育种研究的主要趋势。目前主要的CRISPR/Cas9系统是由产脓链球菌的获得性免疫防御系统改编而来,该系统以其编辑高效、操作方便、成本低廉等明显优势在基因编辑技术中脱颖而出,广受青睐。利用CRISPR/Cas技术编辑作物基因组,能精确引入和改良目标性状,为作物遗传育种提供新途径。当前, CRISPR/Cas9技术在拟南芥、水稻、土豆、玉米等植物中得到普遍应用。该文简要阐述了锌指核酸酶、转录因子激活样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统的结构、作用机制及差异,重点综述CRISPR/Cas9系统目前在植物中的应用、其改良的CRISPR/Cpf1技术以及该系统相比于其他核酸酶的优势与局限性。     

CRISPR/Cas9系统在昆虫中的应用

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种RNA引导的基因组靶向编辑技术,能对基因组序列进行精确编辑,在探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因、改良品质性状等方面具有广阔的应用前景。近年来,随着对CRISPR/Cas9系统研究的不断深入和改造,该系统以其操作简易、省时、高效等优点在生物学研究的众多领域中得以推广和应用,特别是在果蝇(Bombyx mori)、家蚕(silkworm)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和蝴蝶(butterfly)等多种昆虫中。本文概述了CRISPR/Cas9的结构、作用原理及发展优化,总结了CRISPR/Cas9导入昆虫的策略和在昆虫中的应用,以及对CRISPR/Cas9系统产生脱靶问题的应对策略,以期对经济昆虫和有益昆虫的分子育种、害虫的生物技术防控等研究提供参考。     

CRISPR/Cas基因组编辑技术在乳酸菌中的应用及研究展望

乳酸菌是一类重要的食品工业微生物,目前对其功能基因鉴定和挖掘优良功能基因主要依赖于传统的基因同源重组技术,该技术尽管有较高的可靠性,但是存在操作繁琐、效率低下等不足,严重制约了乳酸菌优良菌株的遗传选育。CRISPR/Cas基因编辑技术极大提升了对多物种基因组的编辑效率,这为乳酸菌功能基因的快速鉴定及遗传改良提供了可能,但是现有的CRISPR/Cas基因编辑技术在乳酸菌的应用还存在诸多限制。本文综述了CRISPR/Cas基因编辑技术在乳酸菌基因组上的应用现状及亟待解决的问题,并展望了乳酸菌基因组编辑技术的未来发展趋势,为乳酸菌功能基因鉴定及遗传改良提供参考。     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中技术改进与创新的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术, 可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深, 其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及工作原理, 总结了近几年对该技术进行优化与改进的研究进展, 包括基因组编辑效率的提升、基因组编辑范围的扩展、单碱基精准编辑以及多基因同时编辑、基因组编辑安全性的提升以及基因片段替换与基因靶向转录调控, 以期为深入开展这一领域的研究提供参考。     

CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中技术改进与创新的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项对基因组进行精准修饰的技术,可实现对靶标基因的碱基插入、缺失或DNA片段替换。随着人们对CRISPR/Cas9系统的了解逐渐加深,其在科研、农业和医疗等领域的应用也越来越广泛。该文简要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及工作原理,总结了近几年对该技术进行优化与改进的研究进展,包括基因组编辑效率的提升、基因组编辑范围的扩展、单碱基精准编辑以及多基因同时编辑、基因组编辑安全性的提升以及基因片段替换与基因靶向转录调控,以期为深入开展这一领域的研究提供参考。     

基因组编辑技术在猪遗传改良中的应用

核酸酶介导的基因组编辑技术大幅度提高了编辑真核细胞基因组的能力,给生命科学领域带来了革命性地发展,也给猪的遗传改良带来了全新的契机。本文介绍了基因组编辑技术尤其是CRISPR/Cas9系统的发展以及各种天然存在的和人为改造的Cas9变体的作用特点;汇总了利用基因组编辑技术提高猪生产性能,尤其是改善猪肉品质和抵抗病毒感染的研究进展;分析了目前利用基因组编辑技术推进猪遗传改良所面临的挑战;最后,展望了基于基因组编辑技术的猪遗传改良和品种培育的发展趋势。     

Genome Editing—Principles and Applications for Functional Genomics Research and Crop Improvement

Genome editing technologies are powerful tools for studying gene function and for crop improvement. The technologies rely on engineered endonucleases to generate double stranded breaks (DSBs) at target loci. The DSBs are repaired through the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) and homology-directed repair (HDR) pathways in cells, resulting in mutations and sequence replacement, respectively. In the widely used CRISPR/Cas9 system, the endonuclease Cas9 is targeted by a CRISPR small RNA to DNA sequence of interest. In this review, we describe the four available types of genome editing tools, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cpf1, and show their applications in functional genomics research and precision molecular breeding of crops.     

Plant genome editing: ever more precise and wide reaching

Genome-editing technologies consisting of targeted mutagenesis and gene targeting enable us to modify genes of interest rapidly and precisely. The discovery in 2012 of CRISPR/Cas9 systems and their development as sequence-specific nucleases has brought about a paradigm shift in biology. Initially, CRISPR/Cas9 was applied in targeted mutagenesis to knock out a target gene. Thereafter, advances in genome-editing technologies using CRISPR/Cas9 developed rapidly, with base editing systems for transition substitution using a combination of Cas9 nickase and either cytidine or adenosine deaminase being reported in 2016 and 2017, respectively, and later in 2021 bringing reports of transversion substitution using Cas9 nickase, cytidine deaminase and uracil DNA glycosylase. Moreover, technologies for gene targeting and prime editing systems using DNA or RNA as donors have also been developed in recent years. Besides these precise genome-editing strategies, reports of successful chromosome engineering using CRISPR/Cas9 have been published recently. The application of genome editing to crop breeding has advanced in parallel with the development of these technologies. Genome-editing enzymes can be introduced into plant cells, and there are now many examples of crop breeding using genome-editing technologies. At present, it is no exaggeration to say that we are now in a position to be able to modify a gene precisely and rearrange genomes and chromosomes in a predicted way. In this review, we introduce and discuss recent highlights in the field of precise gene editing, chromosome engineering and genome engineering technology in plants.     

基于CRISPR/Cas系统的病原微生物检测体系构建研究进展

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)自发现以来,其应用范围在不断拓宽。除在基因编辑方面出色的应用能力外,近年来Cas12、Cas13等蛋白反式切割活性的发现,使其在病原微生物快速检测方面也显现出巨大的应用潜力。基于CRISPR/Cas系统建立的病原微生物检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,通过设计不同靶向的引导RNA能够对不同的目标进行快速检测,是一种极具应用潜力的检测技术。本文对基于CRISPR/Cas开发的部分代表性病原微生物检测技术类型进行总结。由于引导RNA在CRISPR/Cas系统中具有重要作用,但目前鲜见相关总结文章,本文对部分Cas蛋白引导RNA特点以及特异性靶标的获取也进行了重点阐述,以期为开发基于CRISPR/Cas系统新型病原微生物检测技术提供参考和依据。     

Current and future editing reagent delivery systems for plant genome editing

Many genome editing tools have been developed and new ones are anticipated; some have been extensively applied in plant genetics, biotechnology and breeding, especially the CRISPR/Cas9 system. These technologies have opened up a new era for crop improvement due to their precise editing of user-specified sequences related to agronomic traits. In this review, we will focus on an update of recent developments in the methodologies of editing reagent delivery, and consider the pros and cons of current delivery systems. Finally, we will reflect on possible future directions.     

Optimized paired‐sgRNA/Cas9 cloning and expression cassette triggers high‐efficiency multiplex genome editing in kiwifruit

Kiwifruit is an important fruit crop; however, technologies for its functional genomic and molecular improvement are limited. The clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR‐associated protein (Cas) system has been successfully applied to genetic improvement in many crops, but its editing capability is variable depending on the different combinations of the synthetic guide RNA (sgRNA) and Cas9 protein expression devices. Optimizing conditions for its use within a particular species is therefore needed to achieve highly efficient genome editing. In this study, we developed a new cloning strategy for generating paired‐sgRNA/Cas9 vectors containing four sgRNAs targeting the kiwifruit phytoene desaturase gene (AcPDS). Comparing to the previous method of paired‐sgRNA cloning, our strategy only requires the synthesis of two gRNA‐containing primers which largely reduces the cost. We further compared efficiencies of paired‐sgRNA/Cas9 vectors containing different sgRNA expression devices, including both the polycistronic tRNA‐sgRNA cassette (PTG) and the traditional CRISPR expression cassette. We found the mutagenesis frequency of the PTG/Cas9 system was 10‐fold higher than that of the CRISPR/Cas9 system, coinciding with the relative expressions of sgRNAs in two different expression cassettes. In particular, we identified large chromosomal fragment deletions induced by the paired‐sgRNAs of the PTG/Cas9 system. Finally, as expected, we found both systems can successfully induce the albino phenotype of kiwifruit plantlets regenerated from the G418‐resistance callus lines. We conclude that the PTG/Cas9 system is a more powerful system than the traditional CRISPR/Cas9 system for kiwifruit genome editing, which provides valuable clues for optimizing CRISPR/Cas9 editing system in other plants.     

CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术在丝状真菌中的研究进展

CRISPR/Cas9技术是在特定的RNA引导下,利用特异的核酸酶实现对基因组进行编辑的新技术。自2013年该技术体系建立起来已成功应用于动物、植物及真菌中。本文简述了3种基于核酸酶的基因编辑技术及其应用,概述了CRISPR/Cas9系统的组成及其作用机理,总结了CRISPR/Cas9在模式真菌酿酒酵母及丝状真菌中的应用,并就在丝状真菌中应用该技术时sg RNA表达盒的设计、Cas9表达盒的优化、抗性标记的筛选、受体的选择等方面提出具体的研究方法。另外,针对该技术应用过程中出现的脱靶效应、Cas9核定位信号的添加、启动子的选择及多个靶基因的编辑等问题提出了建议与展望,希望能够为初次涉足该领域的科研人员提供理论参考和技术支持。     

CRISPR/Cas系统递送技术及其应用研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑系统是近年来研究发展最重要的生物技术之一,其在基因编辑、核酸成像、转录调控、基因检测与疾病诊断、动物模型建立、农作物改良等领域均有十分广泛的应用.本文主要介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的背景与发展历程,梳理了包括纳米载体在内的各类递送技术,总结了该技术应用于疾病治疗的临床前和临床研究进展,简述了CRISPR/Cas在其他更广泛领域的应用,并就该技术面临的挑战、发展趋势和应用前景做了展望.