新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM /IgG抗体检测试剂的研制及性能评价

目的:建立新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)IgM /IgG胶体金抗体联合检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法: 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,分别用刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(receptor binding domain, RBD)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)作为标记抗原,硝酸纤维素膜上包被鼠抗人IgM单抗(M线)和鼠抗人IgG单抗(G线),并用二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)和兔抗DNP多抗为独立C线质控系统制备胶体金检测试剂;比较RBD蛋白和NP蛋白临床测试符合率,选取较优抗原制备检测试剂,对试剂交叉、干扰反应性,加速稳定性及临床诊断特异性和灵敏度进行性能评价。结果: RBD蛋白临床测试总符合率 98.48%(389/395);NP蛋白临床测试总符合率89.11%(352/395),RBD蛋白总符合率高于NP蛋白。选用RBD蛋白制备检测试剂盒,与13种常见病原体抗体阳性样本均无交叉反应;样本中的甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMA)、抗核抗体(ANA)对测试结果无干扰。试剂盒50℃加速破坏6周稳定。临床确诊样本及排除样本测试,IgM灵敏度为78.31%(65/83),特异性为98.90%(721/729);IgG灵敏度为92.77%(77/83),特异性为99.31%(724/729);IgM和IgG联合检测灵敏度为92.77%(77/83),特异性为98.35%(717/729);一致性检验Kappa值为0.883 0,P<0.05。结论: 2019-nCoV IgM/IgG抗体检测试剂(胶体金法)检测性能的特异性和灵敏度高,检测速度快,操作便携,可作为已有的2019-nCoV核酸检测法的补充手段。     

新型冠状病毒亚单位疫苗研究进展及现状*

自新型冠状病毒肺炎在2019年年末暴发以来,如何高效防控疫情一直是紧急的全球公共安全事件。疫苗是有效阻止病毒感染人体、保护高危人群免于疾病快速进展以及遏制疫情进一步扩大的手段之一,其中亚单位疫苗的主要成分为特定的病毒抗原蛋白或多肽,通过加入疫苗佐剂提高抗原的免疫原性。由于机体仅针对重组蛋白表面的特定抗原表位进行识别并产生抗体,因此亚单位疫苗具有较高的保护能力和安全性。通过对目前已上市及处于临床阶段的各类新型冠状病毒亚单位疫苗进行梳理,介绍了各类亚单位疫苗的抗原设计策略和佐剂选择、整体保护能力及研究进展,并对亚单位疫苗的应用及技术优势进行分析,期望能为亚单位疫苗研发及全球疫情防控提供参考。     

新型冠状病毒抗原快速检测研发现状及展望*

新型冠状病毒肺炎疫情的全球大流行,对全球公共健康、社会和经济运转造成了重大影响。在药物研发迟滞及疫苗有效性未得到充分验证的情况下,对人群进行大规模的快速筛查,寻找潜在的感染者(尤其是轻症和无症状患者),并进行集中隔离,切断传播途径和保护易感人群是首要的任务。因此对于SARS-CoV-2感染,早期诊断尤为重要。总结现有市场上的新冠病毒抗原快速检测产品,对全球抗原快速检测市场进行分析,概述其研发的动向并展望了我国在新冠抗原检测新方法、新技术方面的自主创新能力。     

抗新型冠状病毒单克隆中和抗体药物研发进展*

随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在全球的不断蔓延,开发有效的治疗药物迫在眉睫。中和抗体作为最有希望的新型冠状病毒特异性治疗药物,已经在临床研究中展现很好的治疗效果。对抗新冠病毒单克隆中和抗体药物研发的进展、涉及的主要技术和主要临床试验结果进行了总结,以期为包括COVID-19在内的新发、突发传染病中和抗体药物研发提供参考。     

甲胎蛋白胶体金检测试剂的的研制

为建立一种快速,简易胶体金免疫层析法（GICA）用于检测血清中的甲胎蛋白（AFP）,将AFP单克隆抗体分别标记胶体金并包被硝酸纤维素膜,制成免疫检测层析试剂,血清中的AFP与金标记抗体结合,沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗体结合可形成肉眼可见的紫红色线条,此检测试剂对本室自制AFP参比品进行了检测,灵敏度达20ng/ml;对甘肃省肿瘤医院的176份癌症患者血清进行了检测。结果与ELISA法相一致,本法检测AFP快速,简便,结果准确,具有推广价值。     

茄病镰刀菌单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析试纸条的研发*

Objective: The cell lines secreting specific monoclonal antibodies (McAbs) were prepared by using Fusarium solani, one of the pathogenic fungi causing root rot of Fritillaria thunbergii, and the colloidal gold immunochromatographic test strip based on McAbs was developed to provide scientific basis for detecting root rot of F. thunbergii. Methods: Hybridoma technology was used to obtain cell lines that could secrete specific McAbs against F. solani using the whole protein extract of F. solani as the antigen. The specificity, titer, sensitivity and binding protein of McAbs were detected by indirect ELISA and Western blot. Colloidal gold particles were prepared by trisodium citrate reduction method and McAbs were labeled to prepare colloidal gold immunochromatographic strip. Results: Three cell lines secreting specific McAbs against F. solani were obtained, which were named as FsA3, FsG6 and FsD4. The detection sensitivity of FsA3 was 24.41 ng / mL, and that of both FsG6 and FsD4 was 12.21 ng / mL. FsA3, FsG6 and FsD4 had strong reactions to F. solani, and had no cross-reaction to Alternaria tenuissima, A. alternata, Botrytis cinerea, F. equiseti, F. incarnatum, F. oxysporum, Phoma sp., and Phomopsis oblonga. The colloidal gold immunochromatographic strip based on FsG6 showed only a quality control line when detecting the tissue culture seedlings of F. thunbergii. When 100 ng F. solani antigen or the samples of F. thunbergii infested with root rot disease were detected, there were visible quality control lines and test lines. Conclusion: The specificity and sensitivity of the McAbs and test strip are sufficient to detect F. solani isolated from diseased strains of F. thunbergii, which provides the technical support for the rapid detection of root rot of F. thunbergii in the field.     

新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测方法的建立

目的 建立新型冠状病毒(新冠病毒)灭活疫苗抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,并对该方法检测2家企业疫苗的适用性进行验证。方法 使用羊抗S蛋白抗体作为包被抗体,兔抗S蛋白抗体作为显示抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法,并对方法的准确度、精密度进行验证;分别使用该方法及企业自建方法对2家企业生产的各20批次疫苗产品进行检测,评价方法的一致性。结果 成功建立了新冠病毒灭活疫苗抗原含量检测方法,该方法线性良好,R²>0.99。方法验证结果显示,对于2家企业疫苗回收率均在80%～120%范围内,试验内与试验间CV均<10%。方法比对结果显示,该方法与企业方法检测结果比值对于A企业比值在0.83～1.22之间,平均为1.02;与B企业比值在0.91～1.07之间,平均为0.99;不同方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 成功建立了新冠病毒灭活疫苗抗原含量检测方法,该方法的准确性与精密度良好,并且对国内2家企业生产的疫苗具有较好的适用性。     

SARS冠状病毒的起源研究进展*

SARS冠状病毒(SARS—CoV)是一种新现病毒,可感染多种动物,果子狸是人类SARS—CoV重要的动物宿主之一,是已知较理想的实验动物模型。遗传因素在SARS-CoV的出现过程中起重要作用,它很可能是哺乳动物和鸟类冠状病毒之间重组产生的新物种,但发生基因重组不是SARS在人群中暴发的原因。     

流感嗜血杆菌快速检测胶体金试纸的研制

以流感嗜血杆菌外膜蛋白P 6为检测标志物,利用胶体金免疫层析技术建立一种快速、灵敏、准确检测流感嗜血杆菌的方法。对P6蛋白(GenBank登录号:AGH02799)进行生物信息学分析,获取其胞外结构域中抗原表位最丰富的肽段,预测其中的线性抗原表位P6Line (62–75 aa),化学合成后经免疫、抗体纯化得到线性表位抗体,同时利用重组P6蛋白制备多克隆抗体,建立基于双抗体夹心免疫层析技术的流感嗜血杆菌快速检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性和稳定性作出评价,同时对该方法进行临床模拟试验,平板培养法验证其准确性。建立的检测方法可在15 min内完成对样本的检测,检测敏感度高(1×10~5 CFU/mL)、特异性强,与其他诸如肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌等常见9种的呼吸道病原菌无交叉反应;试纸条在25℃保存具有良好的重复性和稳定性;200份临床样品检测结果与平板培养法的阳性符合率为90.5%。P6蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为流感嗜血杆菌检测标的物,胶体金免疫层析法具有快速、简便、灵敏的特点,适用于呼吸道感染的临床快速检测。     

胶体金免疫层析法检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的临床评价与应用

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染暴发流行已成为全球公共卫生事件,急需快速有效的现场诊断试剂。为探讨SARS-CoV-2病毒IgM/IgG抗体胶体金免疫层析法检测效果及临床应用价值,本研究选取304例新冠肺炎临床诊断病例、114例SARS-CoV-2核酸检测阴性的正常人(138)及其他发热伴呼吸道症状病例(64),采用胶体金法对采自上述病例的血浆或血清标本进行IgM和IgG抗体检测,并选取部分病例进行了全血和血浆或血清标本的检测同源性比较,进一步对304例临床诊断病例的病毒核酸、IgM/IgG抗体的时间分布进行了分析。结果显示,304临床诊断病例中,SARS-CoV-2核酸检测阳性病例为105例,胶体金法检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体的敏感性分别为76.2%(80/105)和86.6%(91/105),IgM/IgG抗体阳性总体符合率为96.1%(101/105);核酸、抗体均为阴性者为73例;其余126例临床诊断病例中,IgM阳性率为69.2%(87/126),IgG阳性率为98.3%(125/126),IgM/IgG总体符合率为100%(126/126)。健康人...     

新型冠状病毒纳米PCR快速检测方法的建立

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致致命性肺炎,且极具传染性。自2019年年末在我国出现以来,已在全球蔓延。为了建立一种灵敏、快速检测SARS-CoV-2的分子检测方法,本研究使用金纳米颗粒配合普通PCR检测方法,针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白建立了SARS-CoV-2 NanoPCR新型分子检测方法。特异性结果显示,该方法对猪流行性腹泻病毒、牛冠状病毒、犬冠状病毒、水貂冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性结果显示,该方法的最低检测量为3.69×10⁴拷贝/μL,高于普通PCR最低检测量10倍,表明该方法的敏感性良好。使用建立的方法对3份临床样品进行检测,该方法与普通PCR方法结果一致,10倍稀释样品后,NanoPCR相比较普通PCR条带仍然具有较高辨识度。综上,本研究建立的灵敏、特异的NanoPCR方法可以对临床样品进行快速诊断和鉴定。     

GICA和CLIA联合检测SARS-CoV-2特异性抗体的检测策略研究

评价胶体金免疫层析法(GICA)与化学发光法(CLIA)联合检测对降低新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性抗体假阳性的效果。收集2020年1月22日至2020年3月5日就诊于川北医学院附属医院及南充市中心医院的19例SARS-CoV-2确诊患者不同时段的血清33份,55例非SARS-CoV-2、其他病原体感染及自身免疫性疾病患者的血清55份,采用GICA和CLIA分别对血清SARS-CoV-2 IgM、IgG进行检测,并对结果进行分析。GCIA检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的敏感性分别为100.0%、94.74%,与CLIA(92.86%和100.0%)比较没有差异(P>0.05);GCIA检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的特异性分别为70.91%、74.55%,明显低于CLIA的特异性(98.18%和89.09%)(P<0.01);两种方法检测SARS-CoV-2 IgM、IgG结果具有一致性(P<0.001),Kappa值分别为0.434,0.406;ROC曲线分析发现,GCIA检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的AUC分别为0.855、0.846,明显低于CLIA(0.955和0.945)(P<0.05)。两种方法联合检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的敏感性分别为92.86%、94.74%,特异性分别为100.0%、100.0%;ROC曲线分析显示,联合检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的AUC分别为0.964、0.974,高于两种方法的单独检测。GICA和CLIA联合检测能有效提高SARS-CoV-2 IgM和IgG的检测特异性,值得临床推广应用。     

Construction of Non-infectious SARS-CoV-2 Replicons and Their Application in Drug Evaluation

Virologica Sinica - Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has caused a devastating pandemic worldwide. Vaccines and antiviral drugs are the most promising candidates for...     

Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of botulinum neurotoxin type B

A rapid immunochromatographic assay was developed to detect botulinum neurotoxin type B (BoNT/B). The assay was based on the sandwich format using polyclonal antibody (Pab). The thiophilic gel purified anti-BoNT/B Pab was immobilized to a defined detection zone on a porous nitrocellulose membrane and conjugated to colloidal gold particles that served as a detection reagent. The BoNT/B-containing sample was added to the membrane and allowed to react with Pab-coated particles. The mixture was then passed along the porous membrane by capillary action past the Pab in the detection zone, which will bind the particles that had BoNT/B bound to their surface, giving a red colour within this detection zone with an intensity proportional to BoNT/B concentration. In the absence of BoNT/B, no immunogold was bound to the solid-phase antibody. With this method, 50 ng/ml of BoNT/B was detected in less than 10 min. The assay sensitivity can be increased by silver enhancement to 50 pg/ml. The developed BoNT/B assay also showed no cross reaction to type A neurotoxin (BoNT/A) and type E neurotoxin (BoNT/E).     

新型冠状病毒相关TMPRSS2蛋白结构特征和抗原表位分析

采用生物信息学方法分析预测新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)跨膜蛋白酶丝氨酸2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)的理化特性、结构特征和抗原表位,为抗SARS-CoV-2药物研...     

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)SNV分型检测技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的全球大流行对整个人类社会造成了重大影响,人类面临着财政刺激、金融压力、债务重整等挑战。在特效治疗药物与方法出现之前,大规模的人群筛查隔离成为现在疫情治理的最有效方法。然而,这一次的新冠病毒(SARS-CoV-2)展示出了极高的遗传变异性,截至2022年3月31日统计突变率超过了2.3‰,迄今为止高传染性的新病毒株不断出现,被世界卫生组织正式警告的变异株就达到了7个。因此,在接下来的病毒防控与研究中,不但需要检测SARS-CoV-2,更需要精准、实用的单核苷酸变异(single nucleotide variation, SNV)基因分型技术,特别针对大规模人群筛查中,不仅需要获得SRAS-CoV-2的信息,还需要精准快速区分具有更高传染性与毒性的变异株感染。对病毒的感染和突变机制进行了简要介绍,并着重对现有主要的SARS-CoV-2 SNV分型技术进行了分类综述,希望为新型检测技术的开发提供参考。     

实时荧光定量PCR快速鉴别新型冠状病毒主要变异株北大核心CSCD

为建立一种快速鉴别严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的5种主要变异株的Taq Man探针实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)体系,基于SARS-CoV-2野生型及变异株alpha (N501Y、HV69-70del)、beta (E484K、K417N)、gamma (K417T、V1176F)、delta (L452R、T478K)和omicron (H655Y、N679K、P681H)序列设计特异性引物、探针,建立和优化一种鉴别新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 5种主要变异株的Taq Man探针RT-qPCR方法,并进行该方法的特异性、敏感性、鉴别能力评价。该方法可准确区分出SARS-CoV-2野生型和突变型,与其他呼吸道病原体(n=21)无交叉,显示高特异性。该方法最低检测限为2×10;拷贝/mL,操作简单、快速、成本廉价,可用于监测SARS-CoV-2毒株的变异,精准指导疫情识别与防控。