透明颤菌血红蛋白的表达及其对基因工程菌的影响

利用已克隆的透明颤菌血红蛋白基因,构建了一批复制类型和抗生标记不同的ｖｇｂ表达载体,并就ｖｇｂ基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明ｖｇｂ基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至２０％饱和度时迅速合成。ｖｇｂ基因的表达产物可促进青霉素酰化酶和ＴＮＦ、ＩＬ－２等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于ｖｇｂ基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发     

透明颤菌血红蛋白的研究进展

血红蛋白广泛存在于动植物、微生物中,是一种氧结合蛋白。透明颤菌血红蛋白是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白,该蛋白质能使细菌在低氧的情况下生存,并保持较高的生长速率。随着作用机理研究深入,透明颤菌血红蛋白在发酵工业和植物转基因等生物工程领域有着广泛的应用。     

透明颤菌血红蛋白基因的研究与应用

总结了近 15年来透明颤菌血红蛋白的研究结果 ,包括它的分布、结构、功能、合成等分子生物学以及在基因工程中的应用。透明颤菌的血红蛋白是 2 0世纪 70年代被发现的 ,由于它具有结合氧的特性 ,可使透明颤菌这一专性好氧的革兰氏阴性菌在贫氧环境中生长。透明颤菌血红蛋白是同型二聚体形式的可溶性血红蛋白分子 ,每分子透明颤菌血红蛋白由两个分子量为 15 775的亚基和两个b型血红素组成。透明颤菌血红蛋白的功能是为透明颤菌强大的呼吸膜增加氧的流量。完整的有功能的血红蛋白由血红蛋白亚基和血红素组成 ,血红蛋白亚基由基因vgb编码 ,血红素由生化代谢合成。透明颤菌血红蛋白基因在野生透明颤菌中是以单拷贝的方式随染色体一起复制表达的。透明颤菌血红蛋白基因已经被克隆和测序。同时也讨论了将透明颤菌血红蛋白基因整合到异源宿主菌中增加重组蛋白产量和发酵产量方面的研究。最后 ,概述了当透明颤菌血红蛋白在植物中表达时 ,转基因植物表现出生长增加以及代谢物产量发生变化的情况。     

透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达

将含有自身启动子的透明颤菌血红蛋白基因（ ｖｈｂ） 克隆至大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体ｐＩＪ６５３ 中构建成表达载体ｐ ＷＹ１０１ 和ｐ ＷＹ１０２ ,用它们转化阿维菌素（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ） 产生菌———阿维链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ） ,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析并未检测到ｖｈｂ 基因表达,但用穿梭载体ｐＨＺ１２５２（ 其中的ｖｈｂ 基因位于受硫链丝菌素诱导的链霉菌强启动子ＰｔｉｐＡ之下） 转化阿维链霉菌并经硫链丝菌素诱导,则在该菌中表达出了有活性的ＶＨｂ 蛋白。ｐＨＺ１２５２ 在阿维链霉菌中发生了重组缺失,但缺失的ｐＨＺ１２５２ 上仍含有完整的ｖｈｂ 基因及诱导型强启动子,且可在阿维链霉菌中稳定遗传,却不能再转化大肠杆菌。     

透明颤菌血红蛋白在枯草芽孢杆菌WB800中的表达及其对菌体生长的影响

通过基因工程的方法,将透明颤菌血红蛋白基因(vhb)置于大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pBEP43-DFE的强启动子P43下,构建重组质粒pBEP43-vhb,并通过化学感受态法转入枯草杆菌WB800中,转化子经过酶切和PCR验证。采用一氧化碳差异色谱法测定转入的血红蛋白基因具有表达活性。通过限氧试验表明,血红蛋白基因能在低氧环境下促进菌体的生长。     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

利用PCR法扩增透明颤菌血红蛋白基因条件的优化

以透明颤菌染色体基因组DNA为模板,利用PCR技术获取透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)。在多聚合酶链式反应中采用碱变性模板与热启动等方法进行透明颤菌血红蛋白基因体外扩增,成功地扩增出约0.5 kb的透明颤菌血红蛋白基因,并对vgb的PCR条件进行了研究。获取理想的目的基因PCR反应的综合参数比十分重要。     

透明颤菌血红蛋白的应用进展

透明颤菌血红蛋白（VHb）具有在限氧条件下促进异源宿主细胞生长和增加产物产量的作用,已在发酵、环保、转基因动植物、重组蛋白表达等方面得到了广泛应用。将VHb与酶或蛋白融合表达可提高酶的活性、稳定性或蛋白的分离效率。对VHb进行改造有助于获得性能更良好的"新"蛋白。     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对基因细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌（S.cinnamonensis)是莫能菌素（Monensin)的产生菌,大肠杆菌－链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因（vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子ＰtipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的ＶＨb蛋白,摇瓶发酵实验证明,ＶＨb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

酿酒酵母木糖转运基因研究进展

由于对全球变暖等日益严重的环境问题的担忧,生产生物乙醇等清洁能源的技术正受到世界各国越来越多的关注。较之以粮食为原料生产乙醇,木质纤维素生产生物乙醇具有更大的发展潜力,因其来源广泛,廉价且可再生。以木质纤维素生产生物乙醇已经取得长足进步,但仍面临几个主要问题,比如天然酿酒酵母不能利用木糖发酵乙醇,木质纤维素酶成本过高,木质纤维素预处理环节成本高等。已经有基因改造的酵母菌株可以利用戊糖和己糖进行生物乙醇生产。然而,这些菌株对木糖的利用效率很低。这主要是因为酿酒酵母缺乏高效的特异性木糖转运基因,木糖运输依赖已糖转运基因。为了提高木糖利用速度,已有不少方法成功应用于构建重组酵母细胞。现对酵母木糖转运基因的最新研究进展进行简要概述。     

Reaction kinetics of -glucose fermentation by Saccharomyces cerevisiae

Data obtained on the conversion of -glucose to alcohol using Saccharomyces cerevisiae in batch culture has been analysed kinetically. The effects of different kinetic parameters, e.g. rates of ethanol and biomass formation, rate of -glucose utilization and variation of pH have been studied. Analysis of data was made on the basis of Michaelis-Menten, Leudeking-Piret and simple kinetics. Unsteady rate behaviour in the lag phase was observed and explained.     

Illegitimate integration of single-stranded DNA in Saccharomyces cerevisiae

 We studied illegitimate recombination by transforming yeast with a single-stranded (ss) non-replicative plasmid. Plasmid pCW12, containing the ARG4gene, was used for transformation of yeast strains deleted for the ARG4, either in native (circular) form or after linearization within the vector sequence by the restriction enzyme ScaI. Both circular and linearized ss plasmids were shown to be much more efficient in illegitimate integration than their double-stranded (ds) counterparts and more than two-thirds of the transformants analysed contained multiple tandem integrations of the plasmid. Pulsed-field gel electrophoresis of genomic DNA revealed significant changes in the karyotype of some transformants. Plasmid DNA was frequently detected on more than one chromosome and on mitotically unstable, autonomously replicating elements. Our results show that the introduction of nonhomologous ss DNA into yeast cells can lead to different types of alterations in the yeast genome. Received: 9 February 1996/Accepted: 7 July 1996     

Regio- and enantioselective reduction of methyleneketoesters mediated by Saccharomyces cerevisiae

Methyleneketoesters were readily prepared in high yields by performing a direct -methylenation of the corresponding ketoesters using a previously described protocol. Reactions of ethyl 2-methylene-3-oxo-3-arylpropanoates 2a–c catalyzed by S. cerevisiae were performed with good conversions to give reductions of the CC, CO or both, depending on the reaction conditions and on the substitution of the aryl moiety. Reaction of 3-methylene-2-oxo-4-phenylbutyrate 2d was carried out with free yeast cells and with yeast cells immobilized with calcium alginate, in which the major products resulted from CC and CO bond reduction.

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基于酿酒酵母的大片段DNA组装与转移技术进展*

DNA组装与转移技术是合成生物学的核心使能技术之一,生命体设计改造的复杂度不断提升,使得对大片段DNA组装与转移技术的需求也日益旺盛。小片段DNA的组装与转移技术目前已经比较成熟,大片段DNA由于其分子量大、易断裂,使得体外操作繁琐且效率低下。聚焦酿酒酵母体内组装和转移的技术进展,详细介绍了基于酿酒酵母一次组装和迭代组装的不同方法,并从导入与导出的角度介绍了大片段DNA的转移技术,便于研究者更好地理解和选择酿酒酵母体内组装与转移技术。此外,还展望了将酿酒酵母开发为大片段DNA组装与转移通用平台实现更多物种基因组大尺度设计改造的愿景。     

产对香豆酸酿酒酵母菌株的构建及优化

对香豆酸(p-coumaric acid)作为苯丙素类物质、芪类物质及黄酮类物质的重要前体化合物,在生物医药、化妆品及食品工业中均有广泛的应用价值。以酿酒酵母作为底盘菌株,利用合成生物学原理构建一株高产对香豆酸的人工酵母细胞。通过对比不同拷贝数的酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase)合成的对香豆酸产量,发现随着基因拷贝数的增加对香豆酸的产量也相应提高;同时对酪氨酸的负反馈调控相关的蛋白质进行氨基酸定点突变得到Aro4pK229L和Aro7pG141S,利用delta位点将突变后的基因整合至酵母基因组,并挑取24株构建成功的酵母细胞进行发酵验证,发现菌株最高产量与最低产量相差28.87mg/L;为了进一步增加对香豆酸的代谢通量,对生成芳香醇类物质的旁路基因ARO10和PDC5进行敲除,发现同时敲除两个基因的菌株对香豆酸的产量最高,是敲除前产量的2.05倍(从42.71mg/L到87.56mg/L)。此外,通过设计前体酪氨酸的梯度添加实验,发现当添加1mmol/L的酪氨酸时,对香豆酸产量达到峰值(174.57±0.30)mg/L,相较于未添加时提高了将近1倍。通过运用合成生物学原理在酿酒酵母中实现了对香豆酸的高产,为后续的芪类化合物和黄酮类化合物生物合成奠定了基础。     

酿酒酵母全基因组SNARE蛋白的亚细胞定位研究

在真核细胞中,内质网、高尔基体、质膜等膜结构间的蛋白质运输主要通过囊泡出芽和融合实现。SNARE蛋白家族在介导囊泡与目的膜结构融合过程中发挥关键作用。在模式生物酿酒酵母中,对全基因组SNARE蛋白的系统研究仍有不足。此研究构建了一套用于标记酿酒酵母基因组全部24种SNARE的工具质粒。该系列质粒既能呈现出良好的定位特征,又避免了过度表达造成的定位异常。通过与细胞器标记共定位验证了SNARE蛋白的亚细胞定位。结果发现3种SNARE的定位与之前报道不符:Bos1定位于早高尔基体,Snc1和Bet1定位于晚高尔基体/早内体。另外,Sec9定位于芽尖和芽颈,这是首次观察到Sec9在活酵母细胞中的定位。这项工作首次全面的检验了酵母SNARE家族蛋白的亚细胞定位,为后续SNARE蛋白功能研究提供了新线索,并为相关研究提供了一套工具质粒。