CRISPR/Cas9系统的发展及其在动物基因编辑中的应用 *

CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑技术,主要在DNA水平对生物体的遗传信息进行修改,具有强大的基因编辑能力,目前已经被广泛应用于多个领域,包括基因功能研究、构建动物模型、家畜新品种的培育以及基因治疗等。CRISPR/Cas9技术的不断发展为生物学及医学领域的研究带来了革命性的突破,利用该技术构建基因突变小鼠有助于基因功能的研究,对于遗传疾病的治疗等具有重要的参考价值,同时还可以从基因组水平上有效改善家畜动物的生产性能,提高家畜动物的抗病能力。主要介绍了CRISPR/Cas系统的研究历程、结构与分类,详细阐述了CRISPR/ Cas9技术的作用机制及其在动物基因编辑中的应用,探讨了CRISPR/Cas9在基因编辑动物的制备中存在的问题及优化策略,并对其发展前景进行了展望。     

CRISPR/Cas系统在生物核酸检测中的应用进展

传统的核酸检测技术耗时长且对操作人员的专业水平要求高,开发精准、快速、便携、低成本、高特异性和灵敏度的新核酸检测系统具有重要意义。目前,CRISPR/Cas系统不但被广泛应用于基因编辑,而且随着部分Cas蛋白“附带切割”活性的发现,灵敏度高、特异性强的CRISPR/Cas系统被逐步开发为新型生物传感工具,用于生物的核酸检测。随着各种Cas效应蛋白的发现,研究人员开发了多种基于CRISPR/Cas系统的核酸检测方法(如SHERLOCK、HOLMES、DETECTR、HUDSON和CASLFA等)可检测各种靶标(包括细菌、病毒、癌症突变等)。笔者综述了当前重要的用于不同靶标检测的CRISPR/Cas系统,包括检测核酸、其他小分子物质及病原微生物,讨论了其面临的挑战和应用潜力,最后推断,随着CRISPR/Cas系统的不断发展和完善,该系统在生物传感及临床分子检测领域的应用会越来越广泛。     

CRISPR/Cas系统的研究进展及前沿应用

CRISPR/Cas系统作为一种高效的基因组编辑工具,已经被广泛地研究和应用于各个领域。CRISPR/Cas系统已从最初的CRISPR/Cas9发展到现在的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、CRISPR/dCas等十多种基因编辑系统;从原来的靶向作用于DNA到现在的除了靶向作用于DNA和RNA外,还能应用于转录调控、DNA循环等无需基因编辑的领域。CRISPR/Cas系统以往存在的诸多局限性正在被一个一个突破,该系统的应用已经进入了一个新的时代。本文对CRISPR/Cas系统近些年的发展情况以及新发现的各种CRISPR/Cas系统做了一个总结,并列举了各个系统最新的应用情况。     

CRISPR/Cas系统递送技术及其应用研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑系统是近年来研究发展最重要的生物技术之一,其在基因编辑、核酸成像、转录调控、基因检测与疾病诊断、动物模型建立、农作物改良等领域均有十分广泛的应用.本文主要介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的背景与发展历程,梳理了包括纳米载体在内的各类递送技术,总结了该技术应用于疾病治疗的临床前和临床研究进展,简述了CRISPR/Cas在其他更广泛领域的应用,并就该技术面临的挑战、发展趋势和应用前景做了展望.     

CRISPR/Cas系统的分类及研究现状

CRISPR技术作为一种新型的基因编辑技术,被广泛应用于微生物、动物和植物领域。对CRISPR/Cas系统的起源、分类特点等进行了阐述,重点梳理了CRISPR/Cas系统分类的发展历程,并根据最新分类方法,介绍了不同类型的CRISPR/Cas系统的作用机制、内部不同蛋白的作用特点及应用与发展,以期探寻更多的CRISPR/Cas系统,扩大该系统的应用领域。     

机器学习方法在CRISPR/Cas9系统中的应用

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组定点编辑技术,已被广泛应用于基因编辑和基因表达调控等研究领域。如何提高该技术对基因组编辑的效率与特异性、最大限度降低脱靶风险一直是该领域的难点。近年来,机器学习为解决CRISPR/Cas9系统所面临的问题提供了新思路,基于机器学习的CRISPR/Cas9系统已逐渐成为研究热点。本文阐述了CRISPR/Cas9的作用机理,总结了现阶段该技术面临的基因组编辑效率低、存在潜在的脱靶效应、前间区序列邻近基序(PAM)限制识别序列等问题,最后对机器学习应用于优化设计高效向导RNA (sgRNA)序列、预测sgRNA的活性、脱靶效应评估、基因敲除、高通量功能基因筛选等领域的研究现状与发展前景进行了展望,以期为基因组编辑领域的研究提供参考。     

CRISPR/Cas核酸检测技术的研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术作为强大的基因编辑及基因调控工具,在生命科学研究、生物技术产业、基因治疗等领域得到了广泛的发展与应用.近些年来,基于Cas蛋白(CRISPRassociated protein)特异性及非特异性的核酸切割活性, CRISPR技术在核酸检测领域展现了其简单快速、高效特异的特点,以及在即时检测(point-of-care testing, POCT)领域的应用潜能,可满足临床早期治疗及床旁监护所需的快速诊断需求.根据Cas酶的不同活性(顺式切割活性和反式切割活性),本文将基于Cas酶的核酸检测技术分为两大类,分别为CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12, Cas13, Cas14系统,并阐述了它们各自的工作原理.此外,本文还详细综述了CRISPR/Cas系统与多信号传感器的联合应用,总结了CRISPR/Cas核酸检测技术所存在的缺陷及面临的挑战,并对其未来的发展进行了展望.     

基于CRISPR/Cas9的基因分析方法研究进展

自2012年首次证明了CRISPR/Cas9可以在体外进行DNA切割试验以来,CRISPR技术逐渐在基因编辑研究中获得了迅速的发展,除了应用于基因编辑领域之外,它在基因表达调控、基因成像、基因分析等方面也展现出了巨大的应用潜力。尤其在基因分析领域,CRISPR技术由于其精确的基因识别、室温的反应条件、易设计性和操作性等特色,使得一系列新型的基因检测技术得以发展,并取得了超越常规技术的一些检测参数。本文以Cas9蛋白为对象,综述了近些年来在该领域取得的研究进展。主要论述Cas9蛋白的功能、改造、引导RNA(sgRNA)的设计及其在基因分析方法上的应用。     

CRISPR/Cas及其衍生编辑技术在基因治疗中的应用进展

基因治疗是指利用基因编辑技术对细胞基因进行“修饰”而达到治疗的目的。CRISPR/Cas的出现为基因编辑提供了简单、高效和多功能的平台,同时,为克服DNA双链断裂产生的不良影响,基于CRISPR/Cas的新型技术,如碱基编辑器（base editors,BE）、Prime Editors（PE）和Cas13效应器,被相继开发出来。目前,CRISPR/Cas及其衍生编辑技术已被广泛应用于动物细胞模型构建、药物靶点筛查和基因功能研究等领域,在基因治疗领域也展现出广阔的应用前景。基于此,简要介绍了CRISPR/Cas及其衍生编辑技术,综述了其在单基因遗传病、肿瘤和其他疾病的基因治疗中的应用进展,并分析了其当下面临的挑战,以期为基因编辑在单基因遗传病、肿瘤和其他疾病治疗领域提供理论参考。     

国内外CRISPR/Cas9基因编辑专利技术发展分析

CRISPR/Cas9是一种近年来备受瞩目的基因编辑工具,在医疗、农业、环境等领域呈现出广阔的应用前景。该领域的专利作为技术信息的重要载体,对于CRISPR/Cas9基因编辑工具的情报研究具有重要的意义。现通过分析德温特创新平台DI收录的2005—2017年的CRISPR/Cas9基因编辑技术相关专利,对国内外CRISPR/Cas9基因编辑技术研究领域的专利发展情况与技术布局进行对比,以了解国内外该领域的技术发展状况。     

应用SSA报告载体提高ZFN和CRISPR/Cas9对猪IGF2基因的打靶效率

IGF2(Insulin-like growth factor 2)基因作为最复杂多样的生长因子之一,对猪胎儿发育以及出生后生长发育和肌肉生成起着非常重要的作用。通过基因组编辑技术对我国本地猪种的IGF2基因作精确的遗传修饰,对于提高本地猪种的瘦肉率具有重要的育种意义。文章在蓝塘猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblasts, PEF)中检测了锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)和CRISPR/Cas9对IGF2基因的打靶效率,结果表明CRISPR/Cas9对IGF2基因的切割效率最高可达9.2%,显著高于ZFN的切割效率(<1%),但两者均未达到作为体细胞核移植(Somatic nuclear transfer, SCNT)供体细胞所需的打靶效率。应用SSA (Single-strand annealing)报告载体筛选技术来富集IGF2基因被ZFN和CRISPR/Cas9修饰过的PEF细胞,结果表明,该技术可使CRISPR/Cas9的打靶效率提高5倍左右,对ZFN的打靶效率具有更大的增强作用。     

益生菌的功能基因导入和基因编辑

益生菌已经在临床和食品领域应用多年,其安全性和有效性已经获得人们的认可。随着分子生物学技术的发展,采用益生菌作为载体进行基因导入或基因编辑,这些遗传改造的益生菌一部分已经作为新的药品或疫苗进入到临床应用阶段。携带功能基因的益生菌定殖于肠道进行表达和缓慢释放,这类益生菌作为活体药物获得益生菌和功能基因的双重功效,可用于治疗某些疑难病症。携带蛋白质抗原基因的益生菌定殖于肠道进行表达,可诱导肠道黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫,这是一条更安全的口服疫苗途径。成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)以其高效与便捷性推动了益生菌基因编辑的发展。这篇综述介绍了CRISPR-Cas9操作系统在益生菌方面的应用。对传统遗传操作较难的益生菌采用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑,使其基因敲除和基因突变,基因敲入和基因调控等更为简单、高效和易操作。这些CRISPR/Cas9、CRISPRa和CRISPRi技术在...     

基于CRISPR/Cas系统的病原微生物检测体系构建研究进展

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)自发现以来,其应用范围在不断拓宽。除在基因编辑方面出色的应用能力外,近年来Cas12、Cas13等蛋白反式切割活性的发现,使其在病原微生物快速检测方面也显现出巨大的应用潜力。基于CRISPR/Cas系统建立的病原微生物检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,通过设计不同靶向的引导RNA能够对不同的目标进行快速检测,是一种极具应用潜力的检测技术。本文对基于CRISPR/Cas开发的部分代表性病原微生物检测技术类型进行总结。由于引导RNA在CRISPR/Cas系统中具有重要作用,但目前鲜见相关总结文章,本文对部分Cas蛋白引导RNA特点以及特异性靶标的获取也进行了重点阐述,以期为开发基于CRISPR/Cas系统新型病原微生物检测技术提供参考和依据。     

CRISPR/Cas9技术在非模式植物中的应用进展

基因组编辑技术的出现对植物遗传育种及作物性状的改良产生了深远意义。CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是由成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白组成的免疫系统,其作用是原核生物(40%细菌和90%古细菌)用来抵抗外源遗传物质(噬菌体和病毒)的入侵。该技术实现了对基因组中多个靶基因同时进行编辑,与前两代基因编辑技术:锌指核酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酶(TALENs)相比更加简单、廉价、高效。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、番茄(tomato)等模式植物和多数大作物中实现了定点基因组编辑,其应用范围不断地向各类植物扩展。但与模式植物和一些大作物相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术在非模式植物,尤其在一些小作物的应用中存在如载体构建、靶点设计、脱靶检测、同源重组等问题有待进一步完善。该文对CRISPR/Cas9技术在非模式植物与小作物研究的最新研究进展进行了总结,讨论了该技术目前在非模式植物、小作物应用的局限性,在此基础上提出了相关改进策略,并对CRISPR/Cas9系统在非模式植物中的研究前景进行了展望。     

CRISPR-Cas系统在植物中的研究进展与监管政策

基因编辑技术作为一种颠覆性新技术,现已广泛应用于作物的遗传改良,显示出巨大的发展潜力和应用价值。各国在加快技术研发的同时也十分关注其可能带来的安全性问题,相继出台了基因编辑作物的安全监管政策。综述了目前常用的CRISPR基因编辑系统的原理, 最新开发的一系列CRISPR变体,CRISPR系统在植物中的应用,基因编辑植物检测方法及国际上的相关监管政策,以期为我国基因编辑作物监管政策的制定提供理论数据。     

Rapid generation of genetic diversity by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in rice

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-associated endonuclease 9(CRISPR/Cas9) system has emerged as a promising technology for specific genome editing in many species. Here we constructed one vector targeting eight agronomic genes in rice using the CRISPR/Cas9 multiplex genome editing system. By subsequent genetic transformation and DNA sequencing, we found that the eight target genes have high mutation efficiencies in the T_0 generation. Both heterozygous and homozygous mutations of all editing genes were obtained in T_0 plants. In addition, homozygous sextuple, septuple, and octuple mutants were identified. As the abundant genotypes in T_0 transgenic plants, various phenotypes related to the editing genes were observed. The findings demonstrate the potential of the CRISPR/Cas9 system for rapid introduction of genetic diversity during crop breeding.     

Genome editing with the CRISPR‐Cas system: an art,ethics and global regulatory perspective

Over the last three decades, the development of new genome editing techniques, such as ODM, TALENs, ZFNs and the CRISPR‐Cas system, has led to significant progress in the field of plant and animal breeding. The CRISPR‐Cas system is the most versatile genome editing tool discovered in the history of molecular biology because it can be used to alter diverse genomes (e.g. genomes from both plants and animals) including human genomes with unprecedented ease, accuracy and high efficiency. The recent development and scope of CRISPR‐Cas system have raised new regulatory challenges around the world due to moral, ethical, safety and technical concerns associated with its applications in pre‐clinical and clinical research, biomedicine and agriculture. Here, we review the art, applications and potential risks of CRISPR‐Cas system in genome editing. We also highlight the patent and ethical issues of this technology along with regulatory frameworks established by various nations to regulate CRISPR‐Cas‐modified organisms/products.     

基因编辑产品检测技术研究进展

当前国内外生物技术产业革命加速推进,以基因编辑为代表的转基因新技术发展迅猛,新基因、新性状、新产品不断涌现。围绕基因编辑产品的检测方法将成为转基因生物安全监管的重要一环和有效支撑。因此,基于测序技术、酶切技术、PCR技术和其他检测技术4个方面,总结了目前应用于基因编辑产品检测的一些技术方法,并对每种方法的优缺点进行了分析,以期为今后基因编辑产品的检测提供思路,做好转基因监管技术储备。     

CRISPR/Cas9高通量筛选技术与肿瘤治疗

成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR),是细菌或古菌在与噬菌体长期生存进化获得的一种免疫系统. 根据Cas蛋白(CRISPR-associated protein)的不同,CRISPR系统可分为3种. 其中II型CRISPR/Cas9已被改造成为一种有效的基因编辑工具,并运用于多种物种基因的改造. 作为1种基因编辑的手段,CRISPR/Cas9技术通过诱导DNA双链断裂损伤,进一步干扰基因的表达. 与传统的基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9技术显示出效率高、成本低和易操作等特点. 与此同时,二代测序技术的发展促进全基因组的解析. CRISPR技术结合高通量二代测序手段的使用,在肿瘤的治疗领域中已发挥出了独特的优势. 本文就近年来CRISPR/Cas9高通量筛选技术的发展,及其在肿瘤治疗过程中的应用进行综述.     

CRISPR/Cas9系统的分子机制及其在人类疾病基因治疗中的应用

CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统,用来抵抗外来病毒或质粒的入侵。近几年,由Ⅱ型CRISPR/Cas适应性免疫系统改造而来的CRISPR/ Cas9基因组编辑技术蓬勃发展,被广泛地应用于生命科学研究的各个领域,并取得了革命性的变化。文章主要综述了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的起源与发展及在生命科学各研究领域的应用,重点介绍了该系统在人类疾病基因治疗方面的最新应用及脱靶效应,以期为相关领域的科研人员提供参考。