用于临床新型冠状病毒核酸检测的分子诊断新技术

目前新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)在全球仍呈现大流行趋势,该病潜伏期长、传染性强,给全世界人民的健康安全带来严重威胁。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus2, SARS-CoV-2)核酸检测作为COVID-19确诊的重要依据之一,在疫情防控工作中发挥了巨大的作用。截至2020年8月17日,国家药品监督管理局已应急批准15个新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其中10个试剂盒是以逆转录-实时荧光定量PCR (RT-qPCR)为主要技术原理,其余试剂盒分别采用了不同于RT-qPCR的5种分子诊断技术。本文对上述检测试剂盒所使用的技术原理、反应时间、优缺点等方面进行了介绍,以期为COVID-19及类似传染病的快速筛查、确诊、防控提供更多的方案思路。     

用于新型冠状病毒检测的核酸等温扩增技术研究进展

核酸检测作为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)筛查诊断和病情监测的主要手段,在疫情防控中发挥了重要作用。虽然实时荧光定量PCR被认为是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的金标准,但其依赖荧光定量PCR仪且扩增检测时间较长,难以实现现场快速检测。因此许多基于核酸等温扩增的SARS-CoV-2检测方法相继诞生。等温扩增对仪器温控要求不高,通过与微流控芯片和可视化检测技术结合,可进一步简化操作、降低成本,为SARS-CoV-2现场快速筛查提供有力的技术支撑。本文围绕已报道的SARS-CoV-2等温扩增检测方法原理、检测性能及优缺点进行探讨,为进一步发展SARS-CoV-2现场快速检测平台提供参考。     

一步法双重RT—PCR检测SARS冠状病毒技术研究

参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,建立了一步法RT-PCR检测SARS相关冠状病毒的方法。利用该方法,对武汉市非典型肺炎疑似病例喉澈液进行了SARS相关冠状病毒检测,其中w20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,W1只有BNIin-s／as引物出现预期产物。同时我们将样品W20的RT-PCR扩增产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家分离的SARS冠状病毒基因高度同源性,这进一步说明RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段。在此基础上我们又建立了四种SARS冠状病毒一步法双重RT-PCR检测方法,在一个RT-PCR反应中用两套引物同时对SARS冠状病毒基因两个不同的片段进行检测,检测结果具有更高的特异性。     

对24例宠物临诊病例检测未发现新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸阳性

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种在人体中新发现的冠状病毒,来源于野生动物。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β冠状病毒属,而感染宠物犬猫类的冠状病毒主要来自α冠状病毒属。SARS-CoV-2是否感染犬、猫等宠物是当前抗击新冠肺炎疫情的重要公共卫生问题,也是大众关切的热点问题之一。本研究试图通过对有明晰腹泻和呼吸道症状的宠物犬和猫进行病原学检测,来阐明SARS-CoV-2是否感染宠物的科学问题,探究腹泻和呼吸症状宠物感染的普遍病因。本研究采用SARS-CoV-2的荧光定量PCR试剂和已经建立的诊断方法,对SARSCoV-2流行期间北京地区有腹泻和呼吸道症状的(特别是有发烧、严重咳嗽症状)临床宠物猫病例(20例)和宠物犬病例(4例)采集咽拭子,并进行SARS-CoV-2核酸荧光定量PCR检测和犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(Canine adenoviru-2,CAV-2)、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)、猫疱疹病毒I...     

新型冠状病毒突变株Omicron核酸检测的TaqMan探针设计

Omicron（奥密克戎）作为最新的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）突变株,其带有大量的突变位点,且突变位点主要位于S蛋白上,这不仅会增加再次感染病毒的风险,同时也会大幅降低疫苗和抗体疗法的的效果。Omicron携带的突变虽不影响国内现使用的核酸检测试剂,但这些检测试剂不能有效地鉴别出Omicron突变株。本研究通过对Omicron以及其他SARS-CoV-2突变株的基因序列进行分析,设计了能特异性检测Omicron突变株的TaqMan探针。同时,该探针可与现有的核酸检测体系进行结合,实现SARS-CoV-2核酸检测和Omicron突变株鉴别的双重功能。     

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的迅速传播,导致了新冠肺炎(COVID-19)的全球大流行。COVID-19给世界各国的经济发展和健康生活带来了巨大影响,已成为全球公共卫生关注的核心问题。控制COVID-19大流行的一种有效策略是开发快速识别和隔离SARS-CoV-2感染者的高精度方法。因此,本文总结了SARS-CoV-2病毒核酸检测的技术方法、标本类型和质量控制,对比了各种核酸检测技术的优势和不足及其研究进展和应用,分析了标本和质量控制对检测结果的影响,以期为未来的发展趋势与面临的挑战提供思路。     

基于实时荧光RT-PCR法对新型冠状病毒核酸检测的研究

新型冠状病毒肺炎是由一种新的冠状病毒SARS-CoV-2引起的急性呼吸道传染病,以发热、咳嗽、乏力为主要临床表现,严重者会出现急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。该病毒传染性强,主要通过飞沫传播,已经对人的身体健康、国家经济及世界公共卫生安全造成了严重的损害。目前,临床诊断主要依据患者流行病学、临床表现、胸部CT及实验室检查,其中实验室检查中的实时荧光RT-PCR和基因组测序为诊断金标准。选择快速、高效的病原学检测方法对提高疾病诊断率、治愈率,降低患病率、死亡率起关键作用。RT-PCR相较于基因组测序具有操作简单、周期短的优点,对新型冠状病毒的确诊尤为重要。本文就不同实时荧光RT-PCR法对新型冠状病毒核酸检测的灵敏度、特异性和实用性等方面进行综述,为临床医生选择更为高效的核酸检测方法提供参考。     

新型冠状病毒肺炎患者治疗后不同核酸转阴时间的临床特征比较

目的比较新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia,NCP;亦称为COVID-19)患者治疗后不同时间核酸转阴的临床特征影响因素。方法选取2020年1月23日以来漯河市中心医院(隔离病区)确诊的24例新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, SARS-CoV-2)感染者,取核酸转阴的中位时间20 d为分界点,<20 d者为A组,≥20 d者为B组。比较两组的一般资料、临床表现、相关实验室检查及临床治疗方案的差异。结果 24例NCP患者中男性19例(79.12%),女性5例(20.88%),中位发病年龄41岁。15例患者(62.5%)有武汉旅居史,7例为家庭聚集性发病。有基础疾病者6例(25%)。所有患者入院时白细胞下降7例(29.17%),淋巴细胞下降6例(25%),C-反应蛋白(c-reactive protein,CRP)增高(>10 mg/L)者16例(66.67%),A组发热的中位时间为6 d,B组为8 d,差异无统计学意义(P=0.096)。A组中重症4例,B组重症3例,组间差异无统计学意义(P=1.000)。A组患者应用3种以下抗病毒药物者13例,B组2例,差异有统计学意义(P=0.00)。A组应用激素者4例,B组3例,差异无统计学意义(P=1.000)。结论 NCP患者治疗后核酸转阴快慢与年龄、性别、基础疾病、武汉旅居史、症状持续时间、疾病严重程度、应用激素等均无明确相关性。     

新型冠状病毒抗体检测临床应用的初步研究

探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性总抗体检测的临床应用价值。本研究通过回顾性研究,使用酶联免疫法检测39例确诊的新型冠状病毒肺炎患者、90例健康人群血清样本中的抗体;后对确诊病例不同发病时间的血清样本和40例疑似病例的血清样本进行检测,将抗体检测结果结合核酸检测结果、病例资料进行分析。SARSCoV-2特异性总抗体检测灵敏度为92.31%,特异性为100%;病人血清样本中的总抗体产生时间随时间推移而升高,中位检出时间为13d;1例确诊病例的抗体检测结果先于核酸检测结果呈阳性,40例疑似排除病例的抗体检测结果均为阴性。SARS-CoV-2总抗体检测可作为SARS-CoV-2感染的辅助诊断指标,也可作为排除核酸检测阴性的疑似病例和疫情高发地区人群补充手段,减少非SARS-CoV-2感染患者的核酸检测次数。     

新型冠状病毒的结构基础与新型冠状病毒肺炎的临床药物治疗

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)是指由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus2, SARS-CoV-2)感染导致的肺炎。SARS-CoV-2结合细胞表面受体——血管紧张素转化酶2 (angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)感染肺部细胞,导致白细胞浸润,血管和肺泡壁通透性增加,肺表面活性物质减少,引起呼吸系统症状。局部的炎症加重引起细胞因子风暴,造成全身性炎症反应综合征。2019年12月,武汉市卫生健康委员会报告了多例新型肺炎,分离并确定了病原体SARS-CoV-2。截至2020年9月13日,全世界216个国家或地区受累,2 860余万人确诊COVID-19,90余万人死于该疾病,病死率高达3.20%。到目前为止,尚无特效药物可治疗COVID-19,因此解析病毒结构,探索治疗药物显得尤其重要。本文总结了SARS-CoV-2的病毒结构和COVID-19的临床药物治疗,并分析了他们之间可能的相关性。     

FEN1酶介导的功能核酸生物传感器的研究进展

瓣状核酸内切酶-1(Flap endonuclease 1,FEN1)是一种可以识别三碱基重叠结构(三核酸)并对其进行切割,释放出5’-flap片段的结构特异性酶,并且有着高效稳定的切割效率。基于此种特性,通过不同的信号输出方式,FEN1酶现被用于DNA、RNA、病毒等放大检测中。首先对FEN1酶的发现、性质以及作用方面做了相应介绍,然后根据所检测的靶物质不同,对FEN1酶所介导的生物传感器进行分类,主要包括对单核苷酸多态性的检测、甲基化检测、基因型检测、RNA检测、病毒检测、肿瘤检测和微生物检测等。此外,对FEN1酶与纳米材料的结合以及体内表征及治疗也进行了较为详细的介绍。同时,还对传感器之间的原理、灵敏度、特异性及适用领域等方面进行比较和优缺点的简单评价。最后,对FEN1酶所介导的生物传感器的中存在的不足,以及未来的发展方向进行了展望,旨在为今后研发更便携、更灵敏、更准确的FEN1功能核酸生物传感器提供理论参考。     

等温核酸扩增技术在病原体检测中的应用

近年来,新型传染病相继爆发,如严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）、H7N9禽流感等,严重威胁着人类健康和社会、经济的可持续发展,同时给传染病的防控带来了严峻挑战。病原体检测是传染病防控的重要环节,越来越多的新技术被应用其中。等温核酸扩增技术作为一种快速、灵敏度高的病原体检测技术,已取得了长足发展。对等温核酸扩增技术的原理、重要特性及其在病原体检测中的应用进展进行了较为全面的综述,以期为这一技术的推广和应用提供重要参考。     

核酸恒温扩增技术研究进展

核酸恒温扩增技术在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。我们对核酸恒温扩增技术的最新进展作一简要综述,包括环介导恒温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的扩增、滚环扩增、切口酶核酸恒温扩增、依赖解旋酶的恒温扩增、转录依赖的扩增、杂交捕获法、转录介导的扩增等的原理、优缺点及应用。     

PCR增强剂在核酸体外扩增检测技术的研究进展

在各种高致病性病原体、禽流感病毒、食源性微生物等引起的疾病随时大规模流行的背景下,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对第一例或第一波病例的快速实验室诊断显得尤为重要,同时发展出多种以PCR技术为基础的检测技术以便更加快速、高通量、敏感地对疾病进行诊断、预防或预测。然而,在实际病原体检测中,常常出现灵敏度低、准确性差的结果。PCR增强剂是在PCR及PCR衍生技术中添加的一类物质,其可从产率、特异性、灵敏度等方面提高核酸扩增性能,从而优化核酸检测,解决病原体检测的应用瓶颈,为第一例病原体检出节约宝贵的时间。结合以PCR为基础的核酸体外扩增检测技术对PCR增强剂在其中的应用、优缺点、作用机理进行介绍,以期为病原体核酸检测的实际应用提供一些参考。     

功能核酸用于致病菌检测的研究进展

由食源性致病菌引发的疾病对人类健康构成巨大威胁。虽然一些致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等在诊断和预防方面已经取得了重大进展,但开发快速、高效、低成本的检测方法仍然是一项挑战。功能核酸（functional nucleic acids,FNAs）是一类功能超出核酸常规遗传作用的核酸,主要包括天然的核酶（RNAzymes）、核糖开关（riboswitches）以及体外通过指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）筛选的适配体（aptamers）、核酶（RNAzymes）和脱氧核酶（DNAzymes）。适配体和脱氧核酶因具有较高的稳定性、特异性和可设计性,使其成为病原微生物识别的理想工具,近年来在生物传感和医学诊断领域备受关注。综述了功能核酸的筛选原理和流程、适配体及具有RNA裂解活性的脱氧核酶（RNA cleavage deoxyribozymes,RCDs）在致病菌检测中的应用进展和面临的挑战,并对其未来的发展前景进行了展望。     

核酸检测技术进展及其在SARS-CoV-2核酸检测中的应用

2020年初至今,新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情仍在全球多个国家流行,给全球公共卫生安全造成了严重威胁.中国在应对COVID-19的实践中,最先完成病毒核酸测序并共享序列信息,最早有效控制疫情蔓延、恢复生产,并在病毒作用人体机制研究、疫苗研发、中和性抗体发现等环节均处于世界前沿.其中,针对病毒核酸的检测工作—...     

One New Method of Nucleic Acid Amplification-Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel nucleic acid amplification method, which amplifies DNA with high specificity, sensitivity, rapidity and efficiency under isothermal conditions using a set of four specially designed primers and a Bst DNA polymerase with strand displacement activity. The basic principle, characteristics, development of LAMP and its applications are summarized in this article.     

落叶松cDNA扩增因素优化组合的研究

为了探讨落叶松cDNA扩增因素优化组合,以落叶松总RNA为模板逆转录为cDNA,然后进行PCR扩增,采用四因素三水平正交试验设计,分析比较了几种因素对PCR扩增的影响,结果显示,主要影响因素是Taq酶和Mg^2 ,随机引物和dNTP的影响较小,不同水平的影响作用是：Taq酶以高水平,即用量为2U,Mg^2 以中低水平,即用量为1.5-2.0mmol/L,可以得到多而清晰的条带;反之,则扩增效果差。     

新型冠状病毒SARS-CoV-2检测技术的研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有较强的传播能力,已证实可人传人,无症状携带者也可传播.快速、准确诊断新型冠状病毒对控制疫情爆发尤为重要.论文基于国内外的相关研究进展,就新型冠状病毒的荧光PCR、等温扩增、基于Cas酶技术、免疫法四大类检测技术进行了详细的分析与梳理,以期为新型冠状病毒及其他流行性病毒诊断及防控提供借鉴和思路.