五个WRKY转录因子在水稻叶片生长和抗病反应中的表达研究

WRKY是植物基因组中最大的转录因子家族之一,它们在抗病及其他信号转导途径中发挥着重要的调控作用．为了解水稻WRKY的功能,我们选择了5个WRKY转录因子,用免疫印迹技术调查了它们在水稻叶片生长和在Xa21介导的白叶枯病抗性反应中的表达丰度变化．结果表明,OsWRKY13、23和71在叶片中表达,且随叶片生长而逐步增加,至成熟期略有下降,但在叶片中检测不到OsWRKY45和OsWRKY53的表达信号．在Xa21介导的白叶枯病抗性反应中,OsWRKY45、53和71均受诱导表达,而OsWRKY13和 OsWRKY23蛋白质的表达没有可见的变化．进一步比较OsWRKY45、OsWRKY53和OsWRKY71在抗、感和对照(Mock)反应中的表达,发现它们在抗、感反应中均发生相似变化．上述结果说明,OsWRKY13和OsWRKY23可能在叶片正常生长过程中发挥作用,OsWRKY45和OsWRKY53可能在水稻-白叶枯病菌互作过程中发挥作用,而OsWRKY71在二种条件下均有功能．     

水稻转录因子WRKY42的转录、表达及其与W-box的结合特征分析

WRKY是植物中最大的转录因子家族之一.本文对水稻WRKY42基因的转录分析发现,该基因在水稻苗期和花药中转录,其蛋白质可在各时期的叶片中检测到.在Xa21介导的抗白叶枯病过程中,接菌后期可检测到明显的诱导表达条带,比较其在抗、感和对照反应中的表达丰度发现,在抗、感反应中的表达相似但均明显大于对照反应,推测WRKY42蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作反应中发挥作用.我们克隆并在细菌中表达了WRKY42蛋白质,采用微量热泳动(microscale thermophoresis)技术,调查了WRKY42与病程相关基因PR1a和PR1b启动子区顺式元件W-box的互作,发现它们之间可发生特异结合,其解离常数分别为73.3μmol/L和58.3μmol/L.上述数据提供了WRKY42调控下游基因的直接证据,支持WRKY42在水稻抗病过程中发挥作用.文章提出了WRKY转录因子在水稻与白叶枯病菌互作过程中的作用模式.     

水稻病程相关PR1家族蛋白质在叶片生长及与白叶枯病菌互作反应中的表达北大核心CSCD

病程相关(PR)蛋白质经常被用作抗病反应的分子标记。利用免疫印迹(WB)技术检测了7个PR1家族蛋白质在水稻(Oryza sativa)叶片生长及与白叶枯病菌互作反应过程中的表达,发现6个PR1家族蛋白质在叶片生长中有表达。检测PR1蛋白质在Xa21介导的抗白叶枯病过程中的表达,结果显示PR1#052、PR1#072、PR1#073和PR1#121四个蛋白质在抗病反应后期呈上调或诱导表达,PR1#071则表达下调。进一步比较它们在抗病、感病和对照(Mock)反应中的表达丰度,发现在抗病和感病反应中的变化幅度均明显大于对照反应,推测这些PR蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作反应中发挥作用。另外,对PR1基因上游启动子区的cis元件进行了分析。该研究初步揭示了水稻PR1家族蛋白质的表达谱,为进一步了解PR1蛋白质的功能提供了线索。     

水稻病程相关PR1家族蛋白质在叶片生长及与白叶枯病菌互作反应中的表达

病程相关(PR)蛋白质经常被用作抗病反应的分子标记。利用免疫印迹(WB)技术检测了7个PR1家族蛋白质在水稻(Oryza sativa)叶片生长及与白叶枯病菌互作反应过程中的表达,发现6个PR1家族蛋白质在叶片生长中有表达。检测PR1蛋白质在Xa21介导的抗白叶枯病过程中的表达,结果显示PR1#052、PR1#072、PR1#073和PR1#121四个蛋白质在抗病反应后期呈上调或诱导表达,PR1#071则表达下调。进一步比较它们在抗病、感病和对照(Mock)反应中的表达丰度,发现在抗病和感病反应中的变化幅度均明显大于对照反应,推测这些PR蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作反应中发挥作用。另外,对PR1基因上游启动子区的cis元件进行了分析。该研究初步揭示了水稻PR1家族蛋白质的表达谱,为进一步了解PR1蛋白质的功能提供了线索。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T0代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T1代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

转拟南芥NPR1基因桂99 T3代植株的抗病性及农艺性状表现

以转拟南芥AtNPR1基因的恢复系品种桂99T3代纯合株系为材料,考查其农艺性状及其抗病性,并比较转基因植株与桂99侵染水稻白叶枯病菌后的农艺性状。结果表明:转基因植株表现出对水稻白叶枯病的抗性显著增强77%以上;穗长、剑叶长、有效穗数、一次枝梗数、每穗实粒数、单株产量和谷粒宽等农艺性状与未转基因桂99无显著差别。在受到水稻白叶枯病菌侵染后,转基因植株的一次枝梗数、每穗粒数、每穗实粒数和单株产量等方面均比对照桂99高出13%～78%。说明AtNPR1基因增强了水稻的抗病能力,从而降低了病害引起的产量损失。转基因植株的恢复力不受影响,稻米品质比桂99更加优良。本工作为转基因水稻抗病育种的研究奠定了基础。     

水稻主基因-多基因混合遗传控制白叶枯病抗性的基因效应分析

利用主基因－多基因混合遗传模型分析了５个抗感交组合对水稻白叶枯病菌抗性的基因效应,结果表明５个组合中的３个主基因抗性遗传符合德尔分离比的前提下存在多基因抗性,而且这３个组合彼此间抗病基因的加性效应,主基因和多基因遗传方差及其遗传率存在变异。说明水稻白叶枯病抗性虽以主基因作用为主,但考虑到抗性的持久性,建议在水稻白叶枯病育种中构建主基因－多基因混合遗传体系,以有效抑制白枯病菌群体中小种的波动。     

稻镰状瓶霉对水稻白叶枯病的生物防治

本文研究了野生稻暗色有隔内生真菌稻镰状瓶霉与水稻的共生关系,通过根部接种DsRED荧光标记菌株,观察稻镰状瓶霉在水稻根系内的定殖,并对其抗白叶枯病特性进行调查,结果发现：经叶部接种白叶枯病菌后,对照组发病严重,病级集中在7级和9级,分别占比43.33%和34.67%,病情指数为79.26;相比之下,接种了稻镰状瓶霉的水稻植株发病较轻,叶片病斑面积小,并伴随零星黑色过敏性坏死斑出现,未发病植株占8%,72%的植株病级为1级,病情指数仅为15.26。稻镰状瓶霉对水稻白叶枯病的防治效果达到80.75%。稻镰状瓶霉的定殖能够引起叶片中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性极显著提高,分别是对照组的5.26、12.08和10.53倍;诱导PR1a和PR1b显著上调表达8.71和3.37倍,AOS、OsSAUR2和EL5基因显著下调表达0.28、0.57和0.65倍。利用野生稻内生真菌防控水稻白叶枯病,在国内外尚属首次,可为水稻白叶枯病的生物防治提供新途径。     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T₀代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T₁代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

农杆菌介导将白叶枯病抗性基因Xa21导入水稻获得转基因植株

利用农杆菌介导的高效遗传转化系统,将白叶枯病抗性基因Xa21转入黄淮稻区主栽品种豫粳6号的胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS染色和PCR分析证明Xa21基因已整合到水稻基因组中,其自交T1代植株经GUS染色和白叶枯病接种鉴定呈现3：1分离,研究为培育抗白叶枯病水稻品种奠定了基础。     

Engineering broad-spectrum disease-resistant rice by editing multiple susceptibility genes

Rice blast and bacterial blight are important diseases of rice (Oryza sativa) caused by the fungus Magnaporthe oryzae and the bacterium Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), respectively. Breeding rice varieties for broad-spectrum resistance is considered the most effective and sustainable approach to controlling both diseases. Although dominant resistance genes have been extensively used in rice breeding and production, generating disease-resistant varieties by altering susceptibility (S) genes that facilitate pathogen compatibility remains unexplored. Here, using CRISPR/Cas9 technology, we generated loss-of-function mutants of the S genes Pi21 and Bsr-d1 and showed that they had increased resistance to M. oryzae. We also generated a knockout mutant of the S gene Xa5 that showed increased resistance to Xoo. Remarkably, a triple mutant of all three S genes had significantly enhanced resistance to both M. oryzae and Xoo. Moreover, the triple mutant was comparable to the wild type in regard to key agronomic traits, including plant height, effective panicle number per plant, grain number per panicle, seed setting rate, and thousand-grain weight. These results demonstrate that the simultaneous editing of multiple S genes is a powerful strategy for generating new rice varieties with broad-spectrum resistance.     

水稻OsPR10A的表达特征及其在干旱胁迫应答过程中的功能

利用免疫印迹(WB)分析了水稻(Oryza sativa) OsPR10A在其不同生长时期、不同组织部位及多种非生物逆境胁迫下的表达特征, 发现OsPR10A在干旱、盐胁迫以及茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导下表达量明显升高, 表明该蛋白可能在干旱和盐胁迫应答过程中发挥作用。为证明这一推测, 我们构建了OsPR10A超表达载体, 经农杆菌介导转化水稻, 获得超表达OsPR10A的纯合株系。田间表型观察表明, 转基因株系株高变矮、穗长变短、结实率降低。用20% PEG6000在水稻种子萌发过程中进行干旱处理, 结果显示, OsPR10A超表达株系的根长和芽长均显著高于野生型, 证明超表达OsPR10A可增强水稻萌发期耐旱性。该研究有助于增进人们对水稻OsPR10A功能的了解。     

水稻OsPR10A的表达特征及其在干旱胁迫应答过程中的功能

利用免疫印迹(WB)分析了水稻(Oryza sativa) OsPR10A在其不同生长时期、不同组织部位及多种非生物逆境胁迫下的表达特征, 发现OsPR10A在干旱、盐胁迫以及茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导下表达量明显升高, 表明该蛋白可能在干旱和盐胁迫应答过程中发挥作用。为证明这一推测, 我们构建了OsPR10A超表达载体, 经农杆菌介导转化水稻, 获得超表达OsPR10A的纯合株系。田间表型观察表明, 转基因株系株高变矮、穗长变短、结实率降低。用20% PEG6000在水稻种子萌发过程中进行干旱处理, 结果显示, OsPR10A超表达株系的根长和芽长均显著高于野生型, 证明超表达OsPR10A可增强水稻萌发期耐旱性。该研究有助于增进人们对水稻OsPR10A功能的了解。     

The rice Raf-like MAPKKK OsILA1 confers broad-spectrum resistance to bacterial blight by suppressing the OsMAPKK4–OsMAPK6 cascade

Mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAPKKK) are the first components of MAPK cascades, which play pivotal roles in signaling during plant development and physiological processes. The genome of rice encodes 75 MAPKKKs, of which 43 are Raf-like MAPKKKs. The functions and action modes of most of the Raf-like MAPKKKs, whether they function as bona fide MAPKKKs and which are their downstream MAPKKs, are largely unknown. Here, we identified the osmapkkk43 mutant, which conferred broad-spectrum resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), the destructive bacterial pathogen of rice. Oryza sativa (Os)MAPKKK43 encoding a Raf-like MAPKKK was previously known as Increased Leaf Angle 1 (OsILA1). Genetic analysis indicated that OsILA1 functioned as a negative regulator and acted upstream of the OsMAPKK4–OsMAPK6 cascade in rice–Xoo interactions. Unlike classical MAPKKKs, OsILA1 mainly phosphorylated the threonine 34 site at the N-terminal domain of OsMAPKK4, which possibly influenced the stability of OsMAPKK4. The N-terminal domain of OsILA1 is required for its homodimer formation and its full phosphorylation capacity. Taken together, our findings reveal that OsILA1 acts as a negative regulator of the OsMAPKK4–OsMAPK6 cascade and is involved in rice–Xoo interactions.     

OsMKKK70 regulates grain size and leaf angle in rice through the OsMKK4-OsMAPK6-OsWRKY53 signaling pathway

Grain size and leaf angle are key agronomic traits that determine final yields in rice. However, the underlying molecular mechanisms are not well understood. Here we demonstrate that the Oryza sativa Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase OsMKKK70 regulates grain size and leaf angle in rice. Overexpressing OsMKKK70 caused plants to produce longer seeds. The osmkkk62/70 double mutant and the osmkkk55/62/70 triple mutant displayed significantly smaller seeds and a more erect leaf angle compared to the wild type, indicating that OsMKKK70 functions redundantly with its homologs OsMKKK62 and OsMKKK55. Biochemical analysis demonstrated that OsMKKK70 is an active kinase and that OsMKKK70 interacts with OsMKK4 and promotes OsMAPK6 phosphorylation. In addition, the osmkkk62/70 double mutant showed reduced sensitivity to Brassinosteroids (BRs). Finally, overexpressing constitutively active OsMKK4, OsMAPK6, and OsWRKY53 can partially complement the smaller seed size, erect leaf, and BR hyposensitivity of the osmkkk62/70 double mutant. Taken together, these findings suggest that OsMKKK70 might regulate grain size and leaf angle in rice by activating OsMAPK6 and that OsMKKK70, OsMKK4, OsMAPK6, and OsWRKY53 function in a common signaling pathway that controls grain shape and leaf angle.