CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sgRNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sgRNA 设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sgRNA进行了归纳总结。     

CRISPR/Cas9系统的发展及其在动物基因编辑中的应用 *

CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑技术,主要在DNA水平对生物体的遗传信息进行修改,具有强大的基因编辑能力,目前已经被广泛应用于多个领域,包括基因功能研究、构建动物模型、家畜新品种的培育以及基因治疗等。CRISPR/Cas9技术的不断发展为生物学及医学领域的研究带来了革命性的突破,利用该技术构建基因突变小鼠有助于基因功能的研究,对于遗传疾病的治疗等具有重要的参考价值,同时还可以从基因组水平上有效改善家畜动物的生产性能,提高家畜动物的抗病能力。主要介绍了CRISPR/Cas系统的研究历程、结构与分类,详细阐述了CRISPR/ Cas9技术的作用机制及其在动物基因编辑中的应用,探讨了CRISPR/Cas9在基因编辑动物的制备中存在的问题及优化策略,并对其发展前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因组定点编辑中脱靶现象的研究进展

近年来, CRISPR定点编辑技术发展迅猛, 在动物、植物和微生物中均得到广泛应用。其中, 备受关注的脱靶现象也是研究的热点, 迄今已取得了重要进展。该文介绍了脱靶现象的产生原理及体内和体外检测脱靶现象的方法, 评价了通过改进sgRNA设计和优化CRISPR系统等来降低脱靶率的方法。在植物基因组定点编辑过程中, 应适时检测脱靶现象, 提高脱靶检测的精确度和准确度。     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

机器学习方法在CRISPR/Cas9系统中的应用

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组定点编辑技术,已被广泛应用于基因编辑和基因表达调控等研究领域。如何提高该技术对基因组编辑的效率与特异性、最大限度降低脱靶风险一直是该领域的难点。近年来,机器学习为解决CRISPR/Cas9系统所面临的问题提供了新思路,基于机器学习的CRISPR/Cas9系统已逐渐成为研究热点。本文阐述了CRISPR/Cas9的作用机理,总结了现阶段该技术面临的基因组编辑效率低、存在潜在的脱靶效应、前间区序列邻近基序(PAM)限制识别序列等问题,最后对机器学习应用于优化设计高效向导RNA (sgRNA)序列、预测sgRNA的活性、脱靶效应评估、基因敲除、高通量功能基因筛选等领域的研究现状与发展前景进行了展望,以期为基因组编辑领域的研究提供参考。     

基于体外组装核糖核蛋白形式的CRISPR/Cas9基因编辑方法研究进展 *

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是近年来发展起来的新型的基因编辑技术,在生物医学领域得到广泛应用。CRISPR/Cas9系统需要在gRNA存在的条件下通过Cas9蛋白实现对基因组的定点编辑,通常情况下以慢病毒感染或质粒转染等方式提供Cas9和gRNA。但是,这些方式容易引起免疫反应及基因片段不可控插入,存在一定的风险,限制了CRISPR/Cas9技术在机体的应用。近年来发展起来的基于体外组装的核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)转导入胞的策略由于快捷安全、编辑的脱靶率低等优势引起广泛关注。对Cas9 RNP的转导方式及其应用进行了总结,并就其目前存在的问题进行探讨,以期为CRISPR/Cas9技术的进一步发展提供依据,为拓展其应用奠定基础。     

CRISPR/Cas基因编辑系统研究进展

规律性成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的发现和工程技术对生命科学的发展带来巨大的推动作用。RNA引导的Cas(CRISPR-associated)酶已被用作操纵细胞、动物和植物基因组的工具。这加速了基础研究的步伐,并使其在临床和农业上的应用成为可能。CRISPR/Cas9对在实验系统中进行的功能基因组学的研究有重大影响。CRISPR/Cas9系统自发现以来,因其操作便捷、成本低、特异性高、可同时打靶任意数量基因等优点而被广泛应用。经过近几年研究发现,Cas9变异体(Cas12a、Cas13)有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制,Cas12a极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围,同时其介导的多基因编辑具有明显的优势;Cas13等蛋白能特异性结合和编辑RNA,开启了转录组研究的新篇章。本文主要就CRISPR/Cas的研究背景以及Cas9、Cas12a和Cas13系统研究进展和应用进行综述,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

CRISPR/Cas系统在植物基因组编辑中的应用

在基因组水平上进行植物基因人工改造对农作物的改良具有重要意义。一直以来,科学家都未发现有效的植物基因组编辑的方法。最近发现的CRISPR/Cas系统因其简易和有效性被广泛应用于包括植物在内的多种生物的基因组编辑中。CRISPR/Cas系统仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变。目前CRISPR/Cas系统已成功在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、甜橙(Citrus sinensis)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)以及苔藓植物地钱(Marchantia polymorpha)等植物中实现了定点基因组编辑。综述将对CRISPR/Cas系统在植物中的最新研究进行全面的总结和讨论。     

CRISPR/Cas9:基因编辑的新时代

基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统.其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点.该文对...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在番茄中的应用现状及展望北大核心CSCD

CRISPR/Cas9技术是一种能够快速对基因组靶位点进行特定DNA修饰的编辑工具。该文对近年来国内外有关CRISPR/Cas9技术在改善番茄农艺性状及提高生物、非生物胁迫抗性方面的研究进展进行综述,并集中讨论了CRISPR/Cas9面临的一些问题,为该基因编辑技术在番茄的种质创新及基因功能研究方面的应用提供参考。     

利用CRISPR/Cas9技术对miRNA-125a进行基因编辑的实验研究

近年来, CRISPR/Cas9技术被迅速应用于生物学研究的各个领域。miRNA-125a已被证实与生殖密切相关,研究者在自然流产的患者中发现了异常的miRNA-125a。该研究利用CRISPR/Cas9技术在人绒毛膜滋养层细胞HTR8-S/Vneo中对miRNA-125a进行了定点编辑。对于定点敲除,我们首先在pX458表达载体的基础上额外引入一组启动子和sgRNA骨架序列用于片段敲除,此后分别设计用于单点敲除和片段敲除的sgRNA进行表达载体的构建,表达载体转染HTR8细胞后通过流式分选和T7EI酶切鉴定阳性单克隆;对于定点敲入,我们在体外构建供体载体,与CRISPR表达载体共转染HTR8细胞,通过流式分选和PCR鉴定阳性单克隆。DNA测序结果显示,敲除及敲入阳性单克隆细胞系在指定区域的碱基序列发生了改变; RT-qPCR结果显示,阳性单克隆细胞系中mi RNA-125a-5p和mi RNA-125a-3p的表达量较野生型也发生了相应变化;体外实验还显示, miRNA-125a有抑制HTR8-S/Vneo细胞系增殖及迁移的功能。研究证实, CRISPR/Cas9技术在细胞系中编辑mi RNAs是有效可行的,且对于miRNA-125a的定点敲除,片段敲除的效果要好于单点敲除。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究进展及其应用

随着测序技术的不断进步,获得了越来越多物种的全基因组序列。面对这些海量的基因组数据,基因定点编辑技术是高效捕获目标基因、迅速获得基因功能和应用信息的重要研究手段。CRISPR/Cas9是目前最有效的一种基因定点编辑技术。CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)是广泛存在于细菌及古生菌中的,由细菌体长期进化而形成,能够降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。因此,对CRISPR/Cas9系统的发展、应用,以其在相关研究中的应用前景进行阐述显得尤为必要。     

新生儿短肠综合征的肠内营养研究进展

从喂养方式、喂养过程、营养成分、护理重点等多方面综述新生儿短肠综合征肠内营养的研究进展,并结合患儿的实际病情以及实验室检查结果等指标,提出对患儿进行持续性的肠内营养支持的具体做法：（1）在现实情况允许的条件下,保证用母乳喂养患儿,无法提供母乳的情况下合理配比奶粉,并根据实际需要添加一些纤维和脂类的补充剂,保障患儿健康发育;（2）在给予肠内营养的过程中全程无菌化处理,调节适宜的温度,合理选择药物;（3）应用大规模对照试验方式,通过大数据对比总结出持续肠内营养对短肠综合征患儿的影响,为儿科护理工作提供科学依据。