中国荞麦栽培品种的核型比较分析

通过对我国栽培的10个甜荞（Fagopyrun esculentum)品种和7个苦荞（F.tatricum)品种根尖染色体数目观察和核型比较分析,结果表明：甜荞和苦荞染色体数目都是由16条染色体构成的,2n=2x=16。甜荞有2对随体,而苦荞有1对随体,它们的核型公式分别为12m 4m(SAT)、12m 2sm 2sm(SAT);种内各品种在染色体相对长度、染色体长度比、随体染色体数目和形态等方面差异较小,但在种间的差异明显。     

普通荞麦植株茎段快速繁殖技术的研究

以普通养麦（Fagopyrum esculentum Moench）植株带节茎段为外植体,用正交设计法研究不同激素处理对荞麦腋芽、丛生芽和根的诱导及分化过程的影响,建立了荞麦离体培养快速繁殖技术。极差分析表明,6-BA是诱导荞麦茎段腋芽和根发育的主要因素,TDZ是诱导丛生芽的关键因素。诱导荞麦茎段腋芽发育的最佳培养基为：MS0＋6-BA1．0mg／L＋NAA0．1mg／L,腋芽诱导率为67．9％。其中,以第二、三节位的腋芽诱导率较高,达80％以上。诱导荞麦茎段丛生芽发育的最佳培养基为：MS0＋6-BA4．0mg／L＋TDZ0．06mg／L,丛芽分化率为166．7％。诱导生根的最佳培养基为：1／2MS0＋6-BA1．0mg／L＋NAA1．0mg／L,生根率为82．8％。该组织培养技术的建立为养麦快速繁殖提供了新途径。     

甜荞品种内与品种间的遗传多样性研究

以9个甜荞品种为材料,1个苦荞品种为对照,每个品种随机取10粒种子发芽,提取基因组DNA,采用长随机引物和内含子切接点引物的PCR分子标记技术,对甜荞品种内和品种间的遗传多样性进行了分析.结果表明:(1)所使用的引物均能在 9份甜荞品种和1份苦荞品种中稳定扩增出条带,共获得了45条条带,其中多态性条带42条,占总数的93.3%;(2)甜荞同一品种内存在一定的遗传差异,但遗传距离较小,大部分不同甜荞品种间的遗传差异大于其品种内的遗传差异.因而,在甜荞品种鉴定和遗传多样性研究中,通过品种内适当混合取样可以较好地代表和反映甜荞品种特性.     

光周期对苦荞芽菜生长与品质的影响

苦荞(Fagopyrum tataricum)芽菜是一种新兴健康食品,该研究通过不同光周期(0、4、8、12、16和20 h·d~(-1))处理苦荞芽菜,测定其生物量、叶绿素和主要营养成分的含量以及黄酮合成相关基因的表达水平,以明确不同光周期对苦荞芽菜品质的影响机理。结果表明:(1)随着苦荞芽菜生长时间的增加,芽菜生物量总体呈上升趋势,16 h·d~(-1)光周期时芽菜生长状态最好,鲜重最大。(2)不同光周期对苦荞芽菜各营养成分含量的影响有所差异,可溶性糖含量在芽菜萌发第2天开始逐渐下降,10 d后含量仅为第2天的13.5%～14.5%;花青素含量在芽菜萌发第2天光周期为12 h·d~(-1)时最高(2.16 mg/g),不同光周期处理4～10 d后均显示出降低趋势;芦丁是苦荞芽菜中主要的黄酮类化合物,芦丁含量在不同光周期处理后有所变化且适当的光照有利于其合成和积累,并在处理第4天光周期为16 h·d~(-1)时含量最高(59.60 mg/g)。(3)qRT-PCR分析表明,不同光周期处理的苦荞芽菜中各黄酮合成相关基因的表达量在第2天最高,随生长周期其表达量均不同程度降低,但黄酮醇合成支路关键酶基因FtFLS1和花青素支路基因FtDFR2表达量上升、且显示出强烈的光诱导特征。研究发现,光周期对苦荞芽菜的生物量影响较大,黑暗有利于胚轴伸长,长光周期(16 h·d~(-1))有利于鲜重的增加;在苦荞萌发过程中,苦荞芽菜可溶性糖、花青素和芦丁含量整体呈减少趋势,可溶性糖和花青素含量均在光周期16 h·d~(-1)处理第2天时最高,芦丁含量在光周期为16 h·d~(-1)处理第4天时最高,建议苦荞芽菜在光周期为16 h·d~(-1)生长4 d时采食。     

Identification and characterization of a rhamnosyltransferase involved in rutin biosynthesis in Fagopyrum esculentum (common buckwheat)

Rutin, a 3-rutinosyl quercetin, is a representative flavonoid distributed in many plant species, and is highlighted for its therapeutic potential. In this study, we purified uridine diphosphate-rhamnose: quercetin 3-O-glucoside 6″-O-rhamnosyltransferase and isolated the corresponding cDNA (FeF3G6″RhaT) from seedlings of common buckwheat (Fagopyrum esculentum). The recombinant FeF3G6″RhaT enzyme expressed in Escherichia coli exhibited 6″-O-rhamnosylation activity against flavonol 3-O-glucoside and flavonol 3-O-galactoside as substrates, but showed only faint activity against flavonoid 7-O-glucosides. Tobacco cells expressing FeF3G6″RhaT converted the administered quercetin into rutin, suggesting that FeF3G6″RhaT can function as a rhamnosyltransferase in planta. Quantitative PCR analysis on several organs of common buckwheat revealed that accumulation of FeF3G6″RhaT began during the early developmental stages of rutin-accumulating organs, such as flowers, leaves, and cotyledons. These results suggest that FeF3G6″RhaT is involved in rutin biosynthesis in common buckwheat.     

苦荞类黄酮糖基转移酶FtUFGT1的重组表达与酶学性质分析

黄酮类化合物是苦荞重要的功能性成分,其糖基化修饰可改变生物体内黄酮类化合物的稳定性、可溶性及生物活性。该研究基于苦荞转录组数据并以苦荞叶片中提取的总RNA为材料,利用RT PCR克隆了苦荞类黄酮糖基转移酶(UDP glycose:flavonoidglycosyltransferase,UFGT)基因FtUFGT1,采用无缝克隆方式构建其重组表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态,采用GST resin纯化重组表达的蛋白,采用高效液相色谱(HPLC)技术检测分析纯化后FtUFGT1的酶学性质。结果表明：(1)成功克隆的FtUFGT1编码区为1 413 bp,其编码470个氨基酸,并成功构建了FtUFGT1的重组表达载体pGEX 6p 1 FtUFGT1。(2)经转化苦荞FtUFGT1基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中得到可溶性的表达,并通过GST亲和层析纯化得到高纯度的苦荞FtUFGT1蛋白。(3)HPLC分析显示,以槲皮素为底物,苦荞FtUFGT1可催化异槲皮素的合成,比活力为9.174 U/mg;重组FtUFGT1的最适温度为30 ℃,最适pH为7.0,5%(V/V)的甲醇和0.5%(V/V)的Triton X 100可以显著抑制其活性。研究结果为深入揭示FtUFGT1的生物学功能及体外催化黄酮类衍生物的合成奠定了基础。     

甜荞胰蛋白酶抑制剂cDNA片段的克隆及序列特征

采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等方法从甜荞中纯化出荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsm inhibitor,BTI),经活性鉴定该抑制剂属丝氨酸类蛋白酶抑制剂家族。为了获得BTI的基因序列,并弄清其在体内的表达调控机制,应用RTPCR和3’-RACE等方法,直接体外扩增该抑制剂基因,首次获得总长为361bp的DNA片段(GenBank登录号为AY335158),并命名为BTI-W1。该片段包括一个183bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。由该基因推导的氨基酸序列与已报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI-2的氨基酸序列的同源性达100％。BTI-WI基因的获得,对于深入开展荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能关系的研究具有重要意义,也为荞麦植物资源的开发利用建立了前期研究基础。     

两个荞麦品种的核型分析

本文对南方两个荞麦品种高荞3号和溪荞5号的根尖细胞有丝分裂染色体进行核型分析。结果表明,高荞3号和溪荞5号的核型都为2A,高荞3号和溪荞5号的核型公式分别为2n=2x=16=10m(2SAT)+4sm+2st和2n=2x=16=8m+6sm(2SAT)+2st。     

荞麦野生种的核型及进化特征分析

荞麦起源于我国西南地区,该地区分布着丰富的荞麦野生种,剖析野生荞麦的核型特征对荞麦进化和育种研究具有重要的意义。本研究以甜荞近缘种、硬枝万年荞、疏穗小野荞、细柄野荞、齿翅野荞为试验材料,采用常规压片法进行核型鉴定。结果表明:甜荞近缘种、硬枝万年荞和疏穗小野荞都为二倍体,核型公式分别为2n=2x=16=12M+4m(2SAT)、2n=2x=16=16M、2n=2x=16=14M+2m(2SAT),而细柄野荞和齿翅野荞为四倍体,核型公式分别为2n=4x=32=32M、2n=4x=32=30M+2m(2SAT)。甜荞近缘种和硬枝万年荞核型属1A型,疏穗小野荞、细柄野荞和齿翅野荞核型属1B型,并且甜荞近缘种、疏穗小野荞和齿翅野荞都有1对随体染色体。研究证明,荞麦野生种染色体的基数为8,有二倍体和四倍体野生荞麦。通过比较分析,硬枝万年荞在进化地位上比较原始,齿翅野荞是比细柄野荞较进化的四倍体荞麦野生种。     

Analysis of Seed Phenotypic and Metabolic Characteristics of Diploid and Tetraploid Tartary Buckwheat

Polyploid plants grow well, are stress tolerant, and are rich in nutrients and bioactive compounds. Thus, they are useful for improving crop quality and yield. In this study, we compared the seed characteristics and metabolite profiles of diploid and tetraploid tartary buckwheat, which was developed via an artificially induced chromosome doubling event. The length, width, area, and thousand-grain weight were greater for the tetraploid seeds than for the diploid seeds. However, the germination rate decreased for the tetraploid seeds. Additionally, there was a gap between the shell and kernel of the tetraploid seeds. Moreover, the water absorption rate was higher for the tetraploid than for the diploid seeds. Chromosome doubling increased the seed total flavonoid content and deepened the seed color. A principal component analysis of the ultrahigh-pressure liquid chromatography-high resolution mass spectrometry data revealed the clear separation between the diploid and tetraploid samples. An orthogonal partial least squares-discriminant analysis and other multivariate statistical analyses identified 83 differentially abundant compounds, with most of the flavonoid metabolites more abundant in the tetraploid than in the diploid seeds. Research on tartary buckwheat polyploidy may result in enhanced germplasm resources and may clarify the mechanism underlying the biosynthesis of bioactive compounds.     

基于PAL基因序列的地方苦荞品种遗传多样性分析

苦荞在中国具有广泛的栽培种植地区,长时间演化形成了丰富的遗传多样性。为了研究和利用苦荞资源,以国内北方苦荞产区(内蒙古、青海、陕西、山西、甘肃)、西南苦荞产区(西藏、四川、贵州、云南)、国内其他地方品种(江西、安徽、湖北、湖南、广西)及国外品种(尼泊尔)共计67份苦荞材料为研究对象,PCR扩增其PAL基因并测序。在此基础上分析苦荞的遗传多样性,并采用NJ法(neighbor-joining)对67份苦荞材料构建系统进化树。结果表明,供试的67份苦荞材料的PAL基因序列长度为2011 bp,其中,变异位点为160个,占序列总长度的7.9%,简约信息位点为33个,占序列总长度的1.64%,突变的类型主要是碱基的转换与颠换,高变异位点均集中在外显子2的N端。不同来源的苦荞材料间的遗传距离分布于0.002~0.016之间,来源于中国四川组的苦荞材料种内平均遗传距离最大(0.016),中国内蒙古组的最小(0.002)。中国四川地区的材料与其他地区来源的材料间的遗传距离位于0.010~0.016之间,而其他地区间的遗传距离为0.004~0.013。67份苦荞材料的平均π值和θ值分别为0.0034和0.0143。其中,中国四川材料的π值为0.0148。基于PAL基因序列构建的NJ进化树中,67份苦荞材料分为7个类群,分类与地理来源无关。仅中国西藏来源的5份材料聚集为一类,说明PAL基因序列较为稳定,多数材料间变化差异较小。中国四川地区的苦荞材料具有丰富的遗传多样性,中国西藏地区的某一材料中有较多的SNP位点,推测中国西藏的部分材料可能存在突变的热点区,预示着PAL基因新的突变位点区域。     

Complete Chloroplast Genome Sequence of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum) and Comparative Analysis with Common Buckwheat (F. esculentum)

We report the chloroplast (cp) genome sequence of tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) obtained by next-generation sequencing technology and compared this with the previously reported common buckwheat (F. esculentum ssp. ancestrale) cp genome. The cp genome of F. tataricum has a total sequence length of 159,272 bp, which is 327 bp shorter than the common buckwheat cp genome. The cp gene content, order, and orientation are similar to those of common buckwheat, but with some structural variation at tandem and palindromic repeat frequencies and junction areas. A total of seven InDels (around 100 bp) were found within the intergenic sequences and the ycf1 gene. Copy number variation of the 21-bp tandem repeat varied in F. tataricum (four repeats) and F. esculentum (one repeat), and the InDel of the ycf1 gene was 63 bp long. Nucleotide and amino acid have highly conserved coding sequence with about 98% homology and four genes—rpoC2, ycf3, accD, and clpP—have high synonymous (Ks) value. PCR based InDel markers were applied to diverse genetic resources of F. tataricum and F. esculentum, and the amplicon size was identical to that expected in silico. Therefore, these InDel markers are informative biomarkers to practically distinguish raw or processed buckwheat products derived from F. tataricum and F. esculentum.     

苦荞突变体库构建与突变体中芦丁合成相关基因表达分析

苦荞是重要的小杂粮作物之一,营养物质丰富,是天然芦丁的重要来源。突破苦荞育种难题,创制苦荞新种质是目前研究的重要方面。本试验利用甲基磺酸乙酯(EMS)构建了黑丰1号苦荞突变体库,明确了当EMS浓度为1.2%时,诱变效果较好。通过对M1突变株表型观察统计,共获得叶色、叶型、株型、粒型变异单株102株,突变率为3.85%;高效液相色谱技术(HPLC)测定1000株M3材料,获得高芦丁含量突变株系2个和低芦丁突变体株系5个;qRT-PCR对芦丁含量突变体株系中芦丁代谢关键酶基因(CHS、F3H、4CL、FLS、UFGT)进行表达量分析,发现不同株系中上述基因的表达量与芦丁含量相关性不明显,但个别基因如FtFLS基因表达量在高芦丁含量突变体中达到对照的4.55倍。通过突变体的筛选丰富了苦荞基因资源,创新了苦荞新种质,也为苦荞芦丁代谢的分子基础研究提供了材料保证与技术支持。     

叶面喷施PP_(333)和6-BA对甜荞花芽分化及内源激素的影响

以甜荞品种‘北早生’和‘赤甜荞1号’为材料,利用多效唑(PP_(333))和6-苄基腺嘌呤(6-BA)在不同幼苗时期进行叶片喷施处理,并采用扫描电镜观察花芽分化过程,记录开花时间,调查开花和结实数,通过液质联用方法检测3种内源激素生长素(IAA)、赤霉素(GA_3)、脱落酸(ABA)及人工合成细胞分裂素(6-BA)含量,探究两种植物生长调节剂对甜荞的花芽分化及内源激素含量的影响,为甜荞花期调控提供依据。结果显示:(1)第二片真叶期喷施100mg·L~(-1)PP_(333)和150mg·L~(-1)6-BA能显著提高甜荞结实率和单株产量,两种处理的结实率分别较对照提高49.5%、39.4%,单株产量分别提高41.8%、23.0%。(2)观察甜荞花芽分化过程并将其划分5个时期,分别为生长锥分化前期、生长锥分化期、小花原基分化期、雌雄蕊分化期和雌雄蕊形成期,在第二片真叶期喷施PP_(333)和6-BA均加快了甜荞花芽分化进程,使其开花时间提前。(3)喷施PP_(333)在幼苗期和现蕾期降低了内源IAA、6-BA含量,增加GA_3、ABA含量,而在盛花期增加内源IAA、6-BA含量,降低ABA、GA_3含量;喷施6-BA在幼苗期和现蕾期增加了内源GA_3、IAA含量,在盛花期降低了内源GA_3、IAA含量,3个时期均降低了内源ABA含量,增加了6-BA含量。研究发现,第二片真叶期是调控甜荞小花发育的关键时期,在此时叶面喷施100mg·L~(-1)PP_(333)和150mg·L~(-1)6-BA的调控效果最佳,可加快甜荞花芽分化进程,使开花时间提前,增加单株结实粒数,提高甜荞品种的结实率和单株产量;PP_(333)主要是通过减少甜荞开花数,增强弱势小花活力来提高结实粒数,而6-BA主要是利用增加开花数,提高有效可孕小花数来增加结实粒数。     

顶空气相色谱法检测苦荞麦总黄酮提取物的有机溶剂残留量

为控制使用AB-8型大孔树脂后苦荞麦总黄酮提取物的质量,采用顶空气相色谱法,对提取物中正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、乙苯和苯乙烯等8种残留物进行检测。精密度RSD均小于6％,峰面积与浓度均有良好的线性关系,最低检测限为0．016—0．0640g／mL,回收率均符合要求。试验结果表明,方法稳定、操作简便、准确可靠,适用于使用AB-8型大孔树脂后苦荞麦总黄酮提取物中有机溶剂残留量的检测。     

荞麦与大豆叶片中草酸含量差异及其可能的原因

用1/5浓度Hoagland营养液培养荞麦和大豆幼苗l0 d后,荞麦叶片、根及其分泌物中的草酸含量均明显高于大豆,说明荞麦叶片的草酸形成能力强.荞麦叶片中存在少量的草酸氧化酶活性,而大豆中未检测到该酶活性,表明荞麦具有一定的降解草酸的能力.乙醇酸氧化酶(GO)催化乙醇酸氧化的活性两种植物之间虽差异不明显,但该酶催化乙醛酸氧化的活性荞麦显著高于大豆.荞麦GO对乙醛酸的Km值明显低于大豆GO,同时其乙醛酸含量也较高,因此其叶片中由乙醛酸形成草酸的速率应高于大豆.由此认为,由乙醛酸氧化生成草酸可能是植物草酸合成限速步骤之一,其反应速率高低可能导致不同种类植物叶片中草酸含量的差异.     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.     

不同抗逆性菠萝品种的差异基因和差异代谢物分析

该研究对2个不同抗逆性的菠萝品种PZ2(抗逆性较差)和PZ3(抗逆性强)进行转录组和代谢组比较分析,以探索品种间抗逆性差异的分子生理机制,为菠萝抗性育种提供理论依据。(1)转录组结果显示,以PZ2为对照,在2个品种间共筛选到1 667个差异表达基因,上调和下调的差异表达基因分别为770个和897个;其中筛选到20个与抗逆性相关的差异表达基因,包括WRKY和MYB转录因子基因以及ASR3、SOD1、POD48、HSP20、GSTF1、GSTU17等基因。(2)代谢组分析表明,以PZ2为对照,在2个品种间共筛选到208个差异代谢物,含量上调和下调的差异代谢物分别为98个和110个,其中22种差异代谢物与抗逆性相关,包括氨基酸及其衍生物、脂类、黄酮类、糖类和糖苷等。(3)qRT PCR分析验证表明,所选的8个差异表达基因在菠萝品种PZ2与PZ3中的差异表达趋势与转录组测序中差异基因表达水平变化趋势基本一致。(4)关联分析表明,差异表达基因和差异代谢物共同富集的通路有类黄酮生物合成,苯丙素生物合成,莨宕烷、哌啶和吡啶丙酸盐生物合成,半胱氨酸与蛋氨酸代谢等4条。研究发现,抗逆性强的菠萝品种的非生物逆境反应相关基因、抗氧化酶基因、逆境响应结构基因和调控基因的表达水平高于抗逆性较差的品种,且黄酮类、氨基酸衍生物类及木脂素、脂质等代谢物的含量也高于抗逆性较差的品种。     

苦荞SSR引物开发及其在遗传多样性分析中的应用

苦荞在中国已经成为广受欢迎的健康食品。本研究通过选择性扩增微卫星序列、体外重组扩增产物和构建SSR富集文库,开发出了一种简便的重组微卫星引物设计方法。通过这种方法,设计合成500对SSR引物,在苦荞上的有效性约50%,多态率达10.8%,PIC平均值为0.3600。利用其中的28对SSR引物,在苦荞核心种质中检测出等位基因85个,每位点的等位基因数为2～5个,平均3.0个。不同地理来源的苦荞种质资源的Shannon-Weaver多样性指数为0.3633～0.6671,来自云南、四川和西藏的苦荞材料不但遗传多样性丰富,而且亲缘关系较近,进一步证实苦荞起源于中国西南部。本研究证明重组微卫星引物设计方法开发的引物对苦荞非常有效,将有助于促进苦荞种质资源遗传多样性、有用基因发掘和分子标记辅助育种研究。     

苦荞种质资源评价及遗传育种研究展望

苦荞起源于中国西藏喜马拉雅地区,有上千年的栽培历史。苦荞富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸等丰富的营养物质和黄铜、酚酸等生物活性物质,是药食同源作物。近年来,苦荞的营养保健功能逐渐得到认可,需求量日益增加,苦荞产业也得到了快速发展。中国有着极其丰富的苦荞种质资源(883份),但中国苦荞育种起步晚,育种技术落后,专用型苦荞品种缺乏,严重限制了其产业的发展。该研究对当前中国苦荞种质资源的收集与保存、评价(包括农艺性状、营养成分、功能成分以及抗逆性)和育种等方面的研究进展进行综述,对存在的问题进行了阐述,并对未来中国苦荞育种研究进行了分析展望,以期为中国苦荞研究及育种工作提供参考。