人工抗原合成研究进展

近年来,以小分子化合物为半抗原的免疫分析技术在食品药品、环境保护等领域已有诸多应用,并取得了较为理想的检测效果。小分子化合物只能与载体偶联形成人工抗原后,方能借助T细胞表位间接诱导B细胞进行增殖与分化,进而产生特异性抗体。高效的人工抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键,就近年来国内外有关人工抗原合成过程中所涉及的小分子半抗原的设计与合成方法、载体的选择、半抗原与载体的偶联方法、人工抗原的纯化及鉴定方法等进行综述。     

生长相关蛋白GAP-43多肽抗体的制备

目的对生长相关蛋白-43（growth associated proteins-43,GAP-43）进行抗原表位分析并制备兔多克隆抗体。方法通过对GAP-43 cDNA序列及氨基酸序列的结构进行生物信息分析,依据蛋白质的二级结构、亲水性、疏水性、抗原性及理化特性,经过同源性检索后,综合考虑抗体设计的其他因素,选出具有免疫活性的抗原决定簇多肽片段,采用有机固相多肽合成法合成了GAP-43的多肽片段,并与载体蛋白血蓝蛋白（KLH）偶联制备成抗原,免疫新西兰家兔。结果 ELISA测定GAP-43抗体效价为1∶32 000;Western blot检测结果显示：在分子量25kDa出现单一条带;免疫组织化学法检测显示：GAP-43蛋白在小鼠海马神经元中有表达;免疫细胞化学法检测显示：GAP-43蛋白在人神经母细胞瘤株SH-SY5Y中存在表达。结论利用生物信息学软件比较准确地预测GAP-43的抗原决定簇,并成功制备了高效价、高特异性的多肽抗体。     

血管内皮生长因子全长抗体在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL,评价其在毕赤酵母中的表达产物与抗原的结合特性,及其抑制细胞增殖的活性。方法:利用基因合成分别获得VEGF抗体CL和CH序列,分别构建pPICZαA-CH和pPICZαA-CL重组质粒,再利用同尾酶特性构建双启动子表达盒的重组pPICZαA-CH-CL载体,用Westen印迹对其进行表达鉴定后将VH和VL序列插入该载体,获得VEGF的全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL;通过膜筛和ELISA进行菌株筛选,并对VEGF抗体表达阳性菌株进行小量表达和纯化,采用CCK-8法对其抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性进行初步评价。结果:获得表达轻、重链的VEGF抗体表达载体,ELISA实验证明pPICZαA-VH-CH-VL-CL具有一定的VEGF抗原结合特性;体外增殖实验表明,该抗体可以以剂量依赖性抑制HUVEC增殖。结论:在毕赤酵母中表达、纯化了具有一定功能活性的VEGF全长抗体,为后续比较研究酵母糖基化改造对VEGF抗体的药效学和药代学的影响提供了基础。     

脱落酸人工抗原合成及多克隆抗体制备

目的:为了对植物细胞中的脱落酸(ABA)进行定量和定位分析,研究了脱落酸人工抗原的合成以及多克隆抗体的制备。方法:用重氮化法将ABA分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)联结,得到ABA的免疫抗原和包被抗原,并采用紫外全波长扫描和SDS-PAGE对合成的抗原进行了鉴定。以经过鉴定的抗原免疫白兔,制备出ABA的多克隆抗体;采用间接酶联免疫法(ELISA)对抗血清进行效价检测,通过离子交换层析法获得纯化的抗体。结果:ABA与BSA的平均偶联比为5.3∶1,抗血清效价为1∶16000。结论:人工抗原和多克隆抗体制备成功,为采用ELISA和免疫胶体金技术(ICG)检测ABA提供了有效工具。     

对称性二甲基精氨酸(SDMA) 高效价血清抗体的制备*

目的: 制备高效价SDMA血清多克隆抗体。方法: 先由鸟氨酸合成乙胺基丙胺,再与SDMA合成SDMA半抗原,再用戊二醛法将SDMA半抗原与载体蛋白BSA(或OVA)偶联,合成SDMA完全抗原。完全抗原用弗氏佐剂乳化,免疫2只新西兰大耳白兔,隔两周免疫一次,第五次免疫一周后,心脏取血,分离血清,ELISA法检测血清中抗体的滴度,用竞争ELISA法检测小分子的抑制作用。结果: 两只兔免疫获得的抗SDMA抗体血清滴度分别为1∶128 000和1∶56 000;小分子竞争后两只兔血清吸光度值均接近阴性血清吸光度值,说明小分子抑制作用均良好。结论: 血清中抗体滴度达1∶10⁴以上,小分子抑制作用良好,初步说明SDMA兔血清抗体制备成功。     

己烯雌酚特异性抗体的制备及鉴定

利用4-溴丁酸乙酯对小分子半抗原己烯雌酚(DES)进行活化,引入羧基活性基团,应用活泼酯法将其与牛血清白蛋白(BSA)偶联,合成DES-CP-BSA完全抗原,免疫新西兰长耳白兔,制备特异性抗体.结果显示:成功制备了DES完全抗原,且由此获得了特异性的DES抗体,效价达1.28×105,与己烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应分别...     

抗麻痹性贝毒素GTX2,3单克隆抗体的制备及特性分析

制备抗麻痹性贝毒GTX2,3单克隆抗体。利用醛化法将GTX2,3与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备完全抗原。免疫小鼠,取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。GTX2,3与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联作为检测抗原,用间接ELISA法筛选阳性克隆株。将筛选的阳性细胞株制备腹水。获得三株稳定分泌抗GTX2,3单克隆抗体的杂交瘤细胞株F4、F10、G9。间接ELISA法检测F10细胞株腹水抗体效价为1.4×10^-5。半抗原GTX2,3与载体蛋白偶联后,作为免疫原,可制备高滴度的抗GTX2,3抗血清和单克隆抗体。该抗体对于藻毒素具有高特异性和高亲和力,可用于污染海产品的麻痹性贝毒的检测。     

猪细小病毒NS1蛋白主要抗原表位区的原核表达

目的：用大肠杆菌表达猪细小病毒NS1基因的主要抗原表位区。方法：通过对GenBank发表的猪细小病毒（Porcine Par-vovirus,PPV）中国株非结构蛋白NS1的氨基酸序列分析,确定了其中抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,扩增出包含NS1主要抗原表位区的843bp的片段。酶切后连接到原核表达载体pET30a（＋）上,构建的原核表达载体pET30a-NS1s转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达。结果：重组蛋白大小约为43kD,与预期大小相符。Westernblot分析表明,该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。结论：NS1蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。可作为鉴别诊断抗原用于PPV的临床检测。     

一种新型免疫亲和层析介质的研究

以国产琼脂糖介质为原料,合成了含肼琼脂糖介质。抗体Fc段的糖基经氧化后,可与此种含肼琼脂糖介质偶联,制成高亲和率的免疫亲和层析介质。与溴化氰法相比,这种对抗体上的糖特异的偶联方法制成的免疫亲和层析介质,容量高、稳定性强。用这种含肼琼脂糖介质分别与肿瘤坏死因子和γ-干扰素等的抗体偶联,制成的免疫亲和层析介质可用于分离纯化相应的基因工程产物抗原。     

蜱传脑炎病毒E抗原蛋白的原核表达及鉴定

目的:构建蜱传脑炎病毒(TBEV)结构蛋白E的原核表达载体,表达重组蛋白。方法:PCR扩增E蛋白全长基因片段,插入原核表达载体pET-32a并转化大肠杆菌进行诱导表达,镍柱纯化、复性。结果:E蛋白在大肠杆菌中获得表达,表达量达60 mg/L;重组E蛋白能与人抗TBEV多克隆抗体产生特异反应;用重组E抗原免疫家兔后,能检测到较高的抗体水平。结论:原核表达的E抗原蛋白具有抗体结合活性,可用于制备ELISA诊断试剂。     

沙丁胺醇人工抗原的合成及抗体制备

沙丁胺醇是一种β-兴奋剂,常被很多畜禽水产养殖户非法用于动物养殖。为建立沙丁胺醇在食品中残留的快速检测方法,研究了沙丁胺醇免疫原的合成和抗体的制备方法。采用对氨基苯甲酸法合成了沙丁胺醇（SAL）免疫原SAL-cBSA,采用重氮化法合成的克伦特罗（CL）偶合物CL-cOVA作为包被抗原,用紫外光谱法分析了所合成免疫原和包被抗原。用免疫原SAL-cBSA免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,抗体效价达到32000。采用间接ELISA法检测抗体IC50值为8.79ng/ml,SAL的浓度在1ng/ml~100ng/ml区间时,SAL与对抗体的竞争结合力呈直线关系。表明所制备的沙丁胺醇免疫原具有良好的免疫原性,所制备的抗体拥有很高的灵敏度。     

幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原的可溶性表达及其多克隆抗体的制备和分析*

目的:利用原核表达和蛋白质纯化技术获得高纯度的幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原(rCagL),利用其制备anti-CagL多克隆抗体,并分析抗体的特异性。方法:通过生物信息学软件分析rCagL的抗原结构;利用PCR长片段DNA合成技术合成不含有信号肽序列的幽门螺杆菌致病岛CagL基因,将其插入表达质粒pCzn1中,构建重组质粒pCzn1-rCagL。然后,将pCzn1-rCagL转入大肠杆菌Arctic Express中,经IPTG诱导表达后,通过Ni-IDA镍离子亲和层析纯化重组抗原rCagL,利用Western blot鉴定rCagL与His标签抗体和Anti-H. pylori抗体的免疫反应性;最后,通过rCagL辅以弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,制备anti-CagL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。结果:生物信息学软件表明重组抗原rCagL具有较好的抗原性质;重组质粒pCzn1-rCagL经双酶切和基因测序等技术鉴定,证实rCagL核苷酸序列与理论序列完全一致;基因工程菌株pCzn1-rCagL/Arctic Express在低温11℃条件经IPTG诱导表达。 SDS-PAGE实验结果证实:rCagL可实现相对高效地可溶性蛋白表达,可溶性蛋白约占包涵体的62.07%。经Ni-IDA亲和层析柱纯化,可获得高纯度rCagL,纯度约为96.6%。Western blot结果证实:重组抗原rCagL可特异性与His标签抗体和Anti-H. pylori抗体结合。ELISA结果证实:经rCagL免疫小鼠制备的多克隆抗体anti-CagL可特异性识别rCagL和H. pylori裂解物,具有较高的抗体特异性。结论:重组抗原rCagL在低温条件下可实现可溶性表达,经纯化可获得高纯度抗原蛋白;rCagL具有较好的抗原性,制备的多克隆抗体具有较好的免疫特异性,为发展H. pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。     

金霉素单克隆抗体的制备及检测方法的建立

采用羰基二咪唑法,将半抗原金霉素(AM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备金霉素免疫抗原AM-BSA和检测抗原AM-OVA,通过紫外光谱扫描检测偶联产物。采用细胞杂交瘤技术,制备抗金霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了金霉素竞争ELISA检测方法,其灵敏度达到50ng/ml,且呈现良好的线性关系(r=0.9812),并且与其他抗生素无交叉反应。     

重金属汞螯合物人工抗原的合成与鉴定

以异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸为双功能螯合剂,合成了半抗原,并将半抗原与钥孔戚血蓝素或牛血清白蛋白偶联制备抗原。用二喹啉甲酸(BCA)法测抗原浓度,对半抗原、抗原、KLH和BSA分别进行紫外分光光度计扫描, 利用SDS-PAGE电泳进行定性鉴定,用三硝基苯磺酸法间接测偶联率,用石墨炉原子分光吸收法检测抗原中Hg2+的含量。研究结果表明抗原合成成功, Hg-ITCBE-KLH、Hg-ITCBE-BSA、ITCBE-BSA中载体蛋白ε-氨基的替换程度依次为34.75±4.60％、40.61±0.99％、61.27±0.69％, Hg2+的含量依次为分：38.4±0.5μg/ml、125.5±0.9μg/ml、0μg/ml。     

A radioimmunoassay for deoxycorticosterone sulfate without hydrolysis

The hapten of deoxycorticosterone sulfate was synthesized and linked to the carrier protein through the C-4 position on the steroid nucleus. The antisera raised against this antigen in guinea pigs exhibited high affinity (Ka = 1.86 x 10(9) M-1) and excellent specificity for deoxycorticosterone sulfate. It was found that deoxycorticosterone sulfate can be determined in the range of 50-5000 pg, and this radioimmunoassay in plasma shows a coefficient of variation (CV) less than 10%.     

Creation of DNA vaccine vector based on codon-optimized gene of rabies virus glycoprotein (G protein) with consensus amino acid sequence

An optimized design of the rabies virus glycoprotein (G protein) for use within DNA vaccines has been suggested. The design represents a territorially adapted antigen constructed taking into account glycoprotein amino acid sequences of the rabies viruses registered in the Russian Federation and the vaccine Vnukovo-32 strain. Based on the created consensus amino acid sequence, the nucleotide codon-optimized sequence of this modified glycoprotein was obtained and cloned into the pVAX1 plasmid (a vector of the last generation used in the creation of DNA vaccines). A twofold increase in this gene expression compared to the expression of the Vnukovo-32 strain viral glycoprotein gene in a similar vector was registered in the transfected cell culture. It has been demonstrated that the accumulation of modified G protein exceeds the number of the control protein synthesized using the plasmid with the Vnukovo-32 strain viral glycoprotein gene by 20 times. Thus, the obtained modified rabies virus glycoprotein can be considered to be a promising DNA vaccine antigen.     

邻苯二甲醛(OPA)法检测铝吸附疫苗中抗原含量

目的:建立快速测定铝胶吸附的疫苗中抗原含量的OPA荧光检测法。 方法:利用邻苯二甲醛(OPA)在2-巯基乙醇存在下与氨基酸的N端或L-谷氨酸侧链反应,在460nm处生成荧光衍生物的原理,建立了无需进行抗原蛋白提取的检测方法,并对该方法的特异性、线性、精密度、回收率、重复性进行考察。同时,配合钠十二烷基的硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE),研究在配制过程中抗原蛋白与佐剂是否分离。结果: OPA荧光法,在抗原蛋白含量为0.02~0.16mg/ml时,线性良好,准确度达90%~115%,批内和批间相对标准偏差≤15%。电泳结果显示,CpG的加入可能会导致少量抗原蛋白从铝胶中解离。结论:该方法快速、准确、灵敏度较高,重复性好,可以应用于含铝胶疫苗制剂的实验室甚至生产质控过程。     

Producing peptide arrays for epitope mapping by intein-mediated protein ligation

Peptide arrays are increasingly used to define antibody epitopes and substrate specificities of protein kinases. Their use is hampered, however, by ineffective and variable binding efficiency of peptides, which often results in low sensitivity and inconsistent results. To overcome these limitations, we have developed a novel method for making arrays of synthetic peptides on various membranes after ligating the peptide substrates to an intein-generated carrier protein. We have conducted screening for optimal carrier proteins by immunoreactivity and direct assessment of binding using a peptide derivatized at a lysine sidechain with fluorescein, CDPEK(fluorescein)DS. Ligation of a synthetic peptide antigen to a carrier protein, HhaI methylase, resulted in an improved retention of peptides and an increased sensitivity of up to 10(4)-fold in immunoassay- and epitope-scanning experiments. Denaturing the ligation products with 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) or an organic solvent (20% methanol) prior to arraying did not significantly affect the immunoreactivity of the HhaI methylase-peptide product. Because the carrier protein dominates the binding of ligation products and contains one peptide reactive site, the amount of peptide arrayed onto the membranes can be effectively normalized. This technique was utilized in the alanine scanning of hemagglutinin (HA) antigen using two monoclonal antibodies, resulting in distinguishing the different antigen epitope profiles. Furthermore, we show that this method can be used to characterize the antibodies that recognize phosphorylated peptides. This novel approach allows for synthetic peptides to be uniformly arrayed onto membranes, compatible with a variety of applications.     

Immunogenic activity of synthetic brucellosis antigens

Experimental data obtained in this investigation indicate that the conjugation of Brucella protective antigen with a polymer carrier essentially increase the immunogenic properties of the antigen. Synthesized vaccinal preparations can be of interest for practical use, as these preparations, while inducing the development of intense immunity, do not impede the diagnosis of brucellosis by serological reactions. The comparative study of the conjugates of Brucella antigen with different carriers shows that the conjugated preparation obtained on the basis of modified dextran possesses high protective potency, which makes it possible to regard this carrier as very promising for further use.     

禽白血病病毒p27基因在原核细胞的表达及生物学特性的初步分析

将禽白血病病毒(ALV)的p27基因克隆人表达性载体pET28a,在大肠杆菌以His Tag融合蛋白的形式获得了高效表达。以表达产物免疫家兔,制备了抗ALV p27的多克隆抗体,经亲和纯化后,用此抗体建立了对ALV抗原的双抗体夹心法ELISA,并对疑似病料进行了实验室诊断。检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到98．6％,证明表达产物保留了天然p27蛋白的相关抗原性。交叉试验和群特异性试验证明,此方法具有良好的特异件,并且可以检测出A、B、J亚群的禽白血病病毒p27抗原。用此ALV抗体和所建立的ELISA方法成功地进行了禽白血病病毒抗原的实验室诊断。