高浓度葡萄糖对小鼠囊胚Caspase-8表达的影响

目的:探讨高浓度葡萄糖对小鼠囊胚Caspase-8表达的影响.方法:通过促超排卵,获取妊娠3.5d小鼠囊胚,随机分成三组,即对照组(空白)、低糖组(葡萄糖浓度为7.5mmol/L)和高糖组(葡萄糖浓度为28.0mmol/L),分别培养在含0、7.5mmol/L和28.0mmol/L葡萄糖的M199培养基中,培养24h后,然后再吸出囊胚.每组随机吸取30个囊胚用免疫组织化学S-P法.检测不同浓度葡萄糖对小鼠囊胚Caspase-8表达状况,利用HPIAS-1000图像分析系统测定Caspase-8在以上三组中表达的平均光密度和平均阳性面积率.结果:Caspase-8表达结果:空白组中囊胚细胞胞浆中可见少量浅棕黄色颗粒,Caspase-8表达呈弱阳性.低糖组中囊胚细胞胞浆未见着色,Caspase-8表达呈阴性.高糖组囊胚细胞胞浆中可见较多的棕黄色颗粒,Caspase-8表达呈强阳性.空白组与低糖组囊胚Caspase-8表达的阳性面积率及平均光密度无显著性差异(P>0.05),高糖组与空白组和低糖组相比均存在显著性差异(P<0.01).结论:高浓度葡萄糖可诱导Caspase-8的过度表达,导致囊胚细胞数目过度减少,从而影响囊胚的正常发育和着床.     

镉诱导小鼠睾丸细胞凋亡与Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA的表达

一个月大雄性小鼠24只,随机分为6组,用30 μmol/kg CdCl2作用小鼠睾丸不同的时间(3 h、6 h、12 h、18 h、24 h)后,利用DNA电泳、免疫组化和半定量RT-PCR技术,分析生殖细胞凋亡过程中三种关键物质Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白和mRNA的表达量变化.结果显示:1) DNA各组 (除对照组外)均出现不同程度断裂.2)Caspase-3蛋白表达量一直上升,与对照组相比差异极显著;Bax蛋白在12 h前一直上升,与对照组相比差异显著,12 h后又开始下降,且与对照组相比无显著差异;Bcl-2蛋白在下降,与对照组相比差异显著.3)RT-PCR结果显示Caspase-3基因表达量减少;Bax基因表达量逐渐上升;Bcl-2基因表达量波动很大.综上所述,Caspase-3、Bcl-2和Bax三个基因可能参与了镉应激状态下小鼠睾丸组织细胞的凋亡过程.     

低氧预适应小鼠皮层Bcl-2和Caspase-3的表达变化

本文旨在探讨小鼠皮层Bcl-2和Caspase-3在低氧预适应脑保护中的作用.将Bib/c近交系小鼠随机分为对照组、低氧组和低氧预适应组,用免疫荧光和激光共聚焦显微镜等技术测定皮层顶叶Bcl-2和Caspase-3表达荧光强度和阳性细胞计数.结果显示,低氧组和低氧预适应组Bcl-2表达均显著高于对照组,低氧预适应组又显著高于低氧组.低氧组和低氧预适应组Caspase-3表达均显著高于对照组,但低氧预适应组显著低于低氧组.结果表明,低氧预适应过程中,小鼠皮层脑区通过Bcl-2高表达和Caspase-3低表达抵御皮层细胞凋亡,从而参与脑保护机制.     

靶向miRNA干扰Bmi-1诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3表达的研究

目的:通过靶向抑制原癌基因Bmi-1表达,观察其诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3蛋白表达的效应,探讨其在胆囊癌形成中的机制。方法:通过前期成功构建miRNA-Bmi-1重组质粒转染GBC-SD细胞,然后将其分为miRNABmi-1、miRNAScramble、Lipofectamine、GBC-SD 4组,转染48h后采用RT-PCR和Western blot法检测各组Bmi-1mRNA和蛋白的表达,倒置显微镜观察细胞生长情况;流式细胞技术检测细胞的凋亡率、细胞周期分布及Caspase-3蛋白表达水平。结果:RT-PCR和Western blot结果显示miRNABmi-1组细胞Bmi-1 mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组(P0.05)。倒置显微镜观察显示miRNABmi-1组细胞死亡较对照组明显;细胞周期检测显示:miRNABmi-1组细胞阻滞于G0/G1(72.20±1.71),G2/M和S期细胞减少(18.30±7.21,9.50±6.01),凋亡指数增高(49.83±5.19),Caspase-3蛋白表达量明显增加(30.37±8.10),与对照组比较,具有显著性差异(P0.05)。结论:靶向沉默Bmi-1能有效抑制胆囊癌细胞Bmi-1mRNA及蛋白表达,诱导胆囊癌细胞凋亡,其机制可能是早期使胆囊癌细胞周期阻滞于G0/G1期,并上调了Caspase-3蛋白表达,Bmi-1可能参与调控线粒体依赖的凋亡途径。     

嵌合重组caspase-3诱导表达促进肿瘤细胞凋亡

通过稳定转染人宫颈癌HeLa细胞,建立了野生型caspase-3（wt-casp3）,大小亚基序列颠倒的重组caspase-3 (r-casp3),和N端融合绿脓杆菌外毒素（PE）转膜肽段的嵌合重组caspase-3 (cr-casp3)的诱导表达细胞系.蜕皮素诱导后细胞中检测到目的基因的表达,MTT检测和细胞计数结果表明,r-casp3和cr-casp3诱导表达后有效地导致HeLa细胞死亡,通过测定细胞中caspase-3活性,以及细胞周期检测、DNA梯状电泳条带检测(DNA ladder)、电镜观察等证实r-casp3和cr-casp3诱导表达后细胞发生了凋亡,且二者的促凋亡活性相当,而wt-casp3诱导表达细胞并未出现上述效应.结果表明,与野生型caspase-3活化需要上游分子的切割不同,重组caspase-3具有自发的促凋亡活性,而N端PE肽段的融合不影响这种活性,因此PE转膜结构域和重组caspase-3有望参与构建能转膜进入细胞内部,并杀伤细胞的新型肿瘤治疗分子.     

夏枯草对食管癌细胞Survivin和Caspase-3表达的影响及机制研究

目的：观察夏枯草提取物对人食管癌Eca-109细胞Survivin和Caspase-3基因表达影响,研究夏枯草抗食管癌作用及其机制。方法：IC50浓度夏枯草提取物作用于食管癌Eca-109细胞,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,RT-PCR、Western Blotting法检测Survivin和Caspase-3基因及蛋白表达,Annexin-V-FITC/PI法检测细胞凋亡率。结果：食管癌Eca-109细胞出现增殖抑制, Survivin表达减少,Caspase-3表达增加,细胞凋亡率增高。结论：夏枯草可抑制食管癌Eca-109细胞增殖,抑制Survivin表达,促进Caspase-3表达,促进细胞凋亡。     

雷诺嗪对高糖高脂诱导的NIT-1细胞凋亡的保护作用

目的 研究雷诺嗪对高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞凋亡的保护作用及Cleaved caspase-3表达的影响,探讨雷诺嗪保护胰岛β细胞的机制.方法 采用CCK-8法测定不同浓度的雷诺嗪对体外培养及高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞的增殖能力的影响,同时应用流式细胞术检测NIT-1细胞凋亡,Western blot检测凋亡因子Caspase-3活化片段Cleaved caspase-3蛋白的表达.结果 不同浓度的雷诺嗪对NIT-1胰岛β细胞保护作用呈剂量依赖性:低浓度雷诺嗪对细胞凋亡无明显保护作用,随浓度升高保护作用明显.在培养基中加入高脂高糖及高浓度的雷诺嗪(5μmol/L)共同培养24h,雷诺嗪组细胞凋亡率明显低于高脂高糖单独作用组(P＜0.01),同时相对于高糖高脂组,激活型Caspase3表达明显降低(P＜0.05).结论 雷诺嗪能抑制高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞凋亡,其分子机制可能是雷诺嗪对Caspase-3的激活作用.     

苦参碱对大鼠宫颈癌组织中Survivin、Caspase-3和Caspase-7表达的影响

目的:探讨苦参碱对宫颈癌模型大鼠组织中Survivin、Caspase-3和Caspase-7的表达影响。方法:选取Wistar雌性大鼠34只,宫颈癌造模成功的19只分成阴性对照组(A组)和苦参碱组(B组);未造模的10只大鼠作为正常对照组(C组)。采用免疫印迹法检测三组大鼠宫颈癌组织中Survivin、Caspase-3和Caspase-7表达水平。结果:1A组大鼠组织中Survivin表达明显高于B、C组大鼠组织中Survivin水平,差异有统计学意义(P0.05);2A组大鼠组织中Caspase-3和Caspase-7的表达明显低于B、C组,差异有统计学意义(P0.05);3B组大鼠组织中Survivin、Caspase-3和Caspase-7的表达水平与C组比较存在差异,差异有统计学意义(P0.05)。结论:苦参碱能够明显下调宫颈癌大鼠凋亡抑制因子Survivin水平,改善凋亡因子Caspase-3和Caspase-7的表达。     

唐鱼Caspase-3和Caspase-9 cDNA全长克隆及胁迫表达分析

研究以唐鱼(Tanichthys albonubes)鳃部组织为材料,利用同源克隆和RACE方法,首次克隆得到唐鱼Caspase-3和Caspase-9 cDNA全长序列,并对其生物信息学进行了分析和鉴定。实验结果表明唐鱼Caspase-3 cDNA全长2153 bp,开放读码框(Open Reading Frame,ORF)为840 bp,编码一段长为279个氨基酸的多肽序列;Caspase-9 cDNA全长为1758 bp,ORF为1323 bp,编码440个氨基酸。生物信息学分析表明Caspase-3和Caspase-9与其他鱼类在蛋白结构上较为保守,在重要的功能域呈现高度的保守性。应用实时荧光定量PCR技术,分析了氯氰菊酯对唐鱼鳃部组织表达Caspase-3和Caspase-9的影响,在氯氰菊酯的胁迫下,Caspase-3和Caspase-9的表达呈现抑制状态,且呈现明显的浓度和时间依赖效应。       

二苯乙烯苷对氧化诱导内皮细胞凋亡及Caspase-3和PARP表达的影响

为研究二苯乙烯苷对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响并初步探讨二苯乙烯苷抗凋亡的可能机制,采用不同浓度H2O2和二苯乙烯苷处理内皮细胞24 h,以MTT法检测细胞生长活力、Hoechst33258染色观察细胞形态、流式细胞仪检测凋亡率等方法筛选造模内皮细胞凋亡的H2O2浓度和二苯乙烯苷最佳的抗内皮细胞凋亡作用浓度.RT-PCR、Western-blot分别检测Caspase-3、PARP mRNA及蛋白质的表达.结果发现,与空白对照组相比,300μmol/L H2O2作用后,内皮细胞增殖明显受到抑制,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞,细胞凋亡率显著增加,流式细胞仪检测出明显的凋亡峰,Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达量显著增加.经二苯乙烯苷处理后,随着二苯乙烯苷浓度增加,细胞的增殖率随之增加,凋亡细胞数减少,凋亡率逐渐降低,与H2O2组比较,10μmol/L的二苯乙烯苷能够显著提高细胞增殖率,降低细胞凋亡率,并显著减少Caspase-3和PARP表达.以上结果表明,二苯乙烯苷能够抑制由H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,增加细胞生长活性,降低细胞凋亡率,其作用机制可能与下调Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达有关.     

Caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中的表达

目的观察Caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中的表达。方法实验分正常对照组和实验组,每组10只豚鼠。用破坏并阻塞豚鼠内淋巴囊的方法造成豚鼠内淋巴积水模型。3周后处死豚鼠,取耳蜗分别用石蜡及火棉胶包埋、切片,免疫组织化学方法观察caspase-3在耳蜗的表达。结果caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中表达呈阳性,阳性区域为耳蜗外侧壁和螺旋神经节细胞。结论caspase-3在豚鼠内淋巴积水耳蜗中呈阳性表达,提示在内淋巴积水病理过程中存在耳蜗细胞凋亡。     

Caspase-3在老年豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞的表达

目的检测caspase-3在老年豚鼠耳蜗的表达。方法实验分两组:实验组和对照组,实验组豚鼠年龄为33至35个月之间,对照组豚鼠年龄为2至3个月。用免疫组织化学方法检测caspase-3在两组豚鼠耳蜗的表达。结果Caspase-3在实验组耳蜗的表达呈阳性,阳性区域主要存在于耳蜗螺旋神经节细胞。在对照组耳蜗的表达呈阴性。结论Caspase-3在老年豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞中呈阳性表达,提示caspase-3在豚鼠耳蜗老化过程中起重要作用。     

Ucf-101对大鼠局灶性脑缺血再灌注后Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察Ucf—101对大鼠脑缺血再灌注后神经元caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响,研究其对缺血性脑损伤是否具有保护作用。方法将36只雄性WiStar大鼠随机分为3组：假手术组、缺血组及Ucf—101组,采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）2h再灌注模型,于再灌注后6h和24h断头取脑,采用TTC法测梗死体积,TUNEL法原位标记DNA片段,检测TUNEL阳性细胞的变化,免疫组化法观察脑皮质神经元caspase-3的表达。结果脑缺血再灌注后不同时间点（6h、24h）,Ucf-101组与缺血组相比梗死体积明显缩小,有显著性差异（P〈0．05）;假手术组未见梗死现象。缺血组TUNEL阳性细胞数较假手术组明显增多（P〈0．05）,脑皮质caspase-3的表达较假手术组亦显著增强（P〈0．05）,给予Ucf-101处理后,TUNEL阳性细胞数较缺血组明显减少（P〈0．05）,caspase-3的表达较缺血组亦明显减弱（P〈0．05）。结论Ucf-101能有效地抑制脑缺血再灌注损伤,下调脑皮质神经元Caspase-3蛋白的表达,抑制神经元的凋亡,发挥神经保护作用。     

人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase-3)表达的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组、人参皂苷Rg110、20、40mg/kg组、尼莫地平组,每组10只。采用线栓法栓塞大脑中动脉2h制作大鼠脑缺血再灌注模型;观察再灌注22h后神经功能缺损评分;应用免疫组化、免疫印迹法检测大脑皮层缺血半暗带Caspase-3的表达。结果(1)假手术组、模型组、人参皂苷Rg110、20、40mg/kg组和尼莫地平组神经功能缺损评分分别为0、2.8±0.9、2.1±0.9、1.5±0.7、1.3±1.1、1.5±0.7,差异有统计学意义(P0.05)。人参皂苷Rg120、40mg/kg组与模型组比较,差异有统计学意义(P0.05);人参皂苷Rg110mg/kg组与尼莫地平组比较,差异有统计学意义(P0.05);人参皂苷Rg120、40mg/kg组与尼莫地平组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。(2)免疫组化和免疫印迹结果显示各组大鼠皮层缺血半暗带均有Caspase-3的表达,其中假手术组仅有少量表达,模型组表达最多。与模型组比较,人参皂苷Rg1各剂量组及尼莫地平组Caspase-3表达量减少,差异有统计学意义(P0.05);与尼莫地平组比较,人参皂苷Rg110mg/kg组的Caspase-3表达量显著增高,40mg/kg组显著降低(P0.05),而20mg/kg组则差异无统计学意义(P0.05)。结论人参皂苷Rg1防治脑缺血再灌注的机制与抑制脑组织Caspase-3表达有关,且以高剂量效果较好。     

小鼠2-细胞胚胎单个卵裂球体外培养及其发育形成囊胚的玻璃化冷冻保存技术的研究

单个卵裂球分离和培养是生产同卵双胎或一卵多胎动物的一种有效方法。在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞期胚胎的单个卵裂球的活体后代;在兔也获得来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代;在猪已获得8-细胞单个卵裂球的后代。但多数的研究者发现,小鼠单个卵裂球培养后的体外发育率、移植妊娠率和产仔率都很低。上述均为新鲜胚移植结果,至于分离后卵裂球发育成的囊胚再进行玻璃化冷冻保存尚未见报道。本实     

层粘连蛋白及其肽段对小鼠胚泡粘附和扩展的作用

作为细胞外基质的主要成分之一的层粘连蛋白（ＬＮ）,对小鼠胚泡的粘附、扩展有显著促进作用。ＬＮ分子上的一些活性位点对胚泡的粘附和扩展也具有一定的作用,含ＲＧＤ位点序列的合成肽段ＲＧＤＳ对胚泡的粘附有促进作用;含ＹＩＧＳＲ位点序列的合成肽段ｃＹＩＧＳＲ对胚泡的粘附和扩展均有促进作用;且ＲＧＤＳ和ｃＹＩＧＳＲ可以竞争性抑制ＬＮ对胚泡粘附和扩展的促进作用。以上结果表明ＬＮ对胚泡的作用是通过胚泡上不同的ＬＮ     

VITRIFICATION OF IN VIVO AND IN VITRO PRODUCED OVINE BLASTOCYSTS

Although cryopreservation of bovine embryo has made great progress in recent years, little achievement was obtained in ovine embryo freezing, especially in vitro produced embryos. However, a simple and efficient method for cryopreservation of sheep embryos will be important for application of ovine embryonic techniques such as in vitro fertilization, transgenic, cloning and etc. In this study ovine blastocysts, produced in vivo or in vitro, were cryopreserved by vitrification in EFS40 (40% ethylene glycol (EG), 18% ficoll and 0.5 M sucrose) or GFS40 (40% glycerol (GL), 18% ficoll and 0.5 Mol sucrose). In Vitro produced, early blastocysts were directly plunged into liquid nitrogen (LN₂) after preparation by one of the following procedures at 25°C: (A) equilibration in EFS40 for 1 min; (B) equilibration in EFS40 for 2 min; (C) equilibration in EFS40 for 30 s following pretreatment in 10% EG for 5 min; (D) equilibration in EFS40 for 30s following pretreatment in EFS20 for 2 min (E) equilibration in GFS30 for 30 s following pretreatment in 10% GL for 5 min. The survival rates observed after thawing and in vitro culture for 12 h were A 78.0% (39/50), B 50.0% (26/52), C 93.3% (70/75), D 92.0% (46/50) and E 68.0% (34/50). Survival rates were not significantly different for treatments C and D (p>0.05), but those for groups C and D were significantly higher than for A, B and E (p<0.05). After 24 h in vitro culture, hatched blastocyst rates were A 28.0% (14/50), B 21.1% (11/52), C 49.3% (37/75), D 48.0% (24/50), E 32.0% (16/50) and control 54.0% (27/50). The hatching rates for groups A, B and E were significantly lower than the control (p<0.05) in which early IVF blastocysts were cultured in fresh SOFaaBSA medium following treatment in PBS containing 0.3% BSA for 30 min, but for groups C and D it was similar to the control (p>0.05). The freezing procedures A, B and C were used to vitrify in vivo produced, early blastocysts recovered from superovulated ewes. The survival rates of frozen-thawed in vivo embryos were A 94.7% (72/76), B 75.0% (45/60) and C 96.4% (54/56) and for group B was significantly lower than for the other two treatment groups (p<0.05). Hatched blastocyst rates were A 46.0% (35/76), B 26.6% (16/60), C 51.8% (29/56) and the control 56.7% (34/60) in which early blastocysts from superovulation were cultured in fresh SOFaaBSA medium following treatment in PBS containing 0.3% BSA for 30 min. The hatching rate for treatment B was significantly lower than for the control (p<0.05) but did not differ between groups A, C and the control (p>0.05). Frozen-thawed embryos vitrified by procedure C were transferred into synchronous recipient ewes. Pregnancy and lambing rates were similar for embryos transferred fresh or frozen/thawed for both in vivo and in vitro produced embryos. These rates did not differ between in vivo and in vitro embryos transferred fresh (p>0.05). However, for frozen-thawed embryos, both rates were significantly lower for in vitro than for in vivo produced embryos (p<0.05).     

羊栖菜多糖诱导lovo细胞凋亡及其机理探讨

本课题研究羊栖菜多糖(Sargassum Fusiforme Polysaccharides,SFPS)诱导人大肠癌lovo细胞凋亡及凋亡过程中Caspase-3的变化及其意义。MTT法检测SFPS对大肠癌细胞增殖的抑制率;通过电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术鉴定细胞凋亡;应用Western blot法测定Caspase-3酶原的变化; RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达。结果显示:SFPS作用lovo细胞24,36,48和72h的IC_(50)分别为375,355,178和60mg/L,表明对lovo细胞具有显著生长抑制作用。在电镜下,可见明显的细胞凋亡特征:细胞膜表面微绒毛减少、染色质固缩、边集,凋亡小体形成。在琼脂糖凝胶电泳中,药物浓度为5-300mg/L作用24h后,显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带;而500mg/L处理后梯状条带模糊,开始出现“涂片状”,表明在高药物浓度的作用下,细胞有坏死。流式细胞仪测得细胞凋亡率有剂量的依赖性;DNA直方图出现亚G1峰,但细胞周期时相的分布无明显改变。SFPS处理lovo细胞后,发现Caspase-3酶原蛋白表达降低,Caspase-3的mRNA高表达,并具有剂量和时间的依赖性。实验结果提示,SFPS在体外能够诱导lovo细胞凋亡,这可能是SFPS抑制肿瘤增殖的机制之一,而Caspase-3的活化参与了SFPS诱导lovo细胞凋亡的调控。     

羊栖菜多糖诱导lovo细胞凋亡及其机理探讨

本课题研究羊栖菜多糖（Sargassum Fusforme Polysaccharides．SFPS）诱导人大肠癌lovo细胞凋亡及凋亡过程中Caspase-3的变化及其意义。MTT法检测SFPS对大肠癌细胞增殖的抑制率：通过电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术鉴定细胞凋亡：应用Westernblot法测定Caspase-3酶原的变化：RT—PCR检测Caspase-3mRNA表达。结果显示：SFPS作用lovo细胞24,36,48和72h的IC50分别为375,355,178和60mg／L,表明对lovo细胞具有显著生长抑制作用。在电镜下,可见明显的细胞凋亡特征：细胞膜表面微绒毛减少、染色质固缩、边集,凋亡小体形成。在琼脂糖凝胶电泳中,药物浓度为5—300mg／L作用24h后,显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带：而500mg／L处理后梯状条带模糊,开始出现“涂片状”,表明在高药物浓度的作用下,细胞有坏死。流式细胞仪测得细胞凋亡率有剂量的依赖性;DNA直方图出现亚G1峰,但细胞周期时相的分布无明显改变。SFPS处理lovo细胞后,发现Caspase-3酶原蛋白表达降低,Caspase-3的mRNA高表达,并具有剂量和时间的依赖性。实验结果提示,SFPS在体外能够诱导lovo细胞凋亡,这可能是SFPS抑制肿瘤增殖的机制之一．而Caspase-3的活化参与了SFPS诱导lovo细胞凋亡的调控。