差异表达基因克隆技术的进展

分离并克隆差异表达基因,不仅有助于揭示生命的奥秘,而且还能为基因诊断与治疗提供重要的理论依据。基因差异表达的变化有两种,即新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。以前,过多强调克隆新出现的表达基因,忽略表达量差异的基因。目前研究认为,表达量差异的基因...     

用改进的差别显示法克隆R6大鼠细胞的癌相关基因

为了识别参与细胞癌变的基因,本文选择p53135-val-过表达正常细胞系R6#13-8及其自发转化癌变细胞系T2作为研究材料,在克隆差异表达基因的同时,建立了一种简单、快速的差异表达基因分离的方法,并已克隆到2个与细胞癌变相关的候选新基因。本文所得的实验结果表明这种方法实验步骤简单,避免使用同位素,RT-PCR扩增带的重复性好,能克隆到大于500bp的差异表达cDNA片段,差异表达的PCRcDNA片段假阳性率低,并可广泛适用于在两个或两个以上相对应真核细胞RNA群体中分离和克隆特异表达基因。研究结果还提示在R6#13-8自发转化为T2的过程中涉及多个基因的激活与失活,这两个细胞系之间存在明显的基因表达差异。     

用表达性差异显示分析技术分离人胎肝组织选择性表达基因

目的：建立4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库,为研究胚胎肝组织特异表达基因提供有力的工具。方法：采用表达性差异显示分析（representational difference analysis,RDA) 技术建立4月龄人胎肝组织选择性表达基因EST库,并测定部分克隆核苷酸序列,以竞争PCR检测代表性基因的差异表达。结果与结论：以珠蛋白家族基因为标志,所建差减cDNA文库中α－珠蛋白家族基因的表达频率较未差减cDNA文库增高7倍,同时该文库也含有多种与肝生长密切相关的基因,表明RDA技术确是研究差异表达基因的有效手段,所建EST库富集胎肝特异表达基因。部分克隆序列分析获得2种未报道序列,其中一株含有丝／苏氨酸激酶结构域,表明可望从此库中分离具有重要未知功能的新基因。     

银鲫原肠胚差异表达基因的筛选

胚胎发育是基因组中各个基因在时间和空间上选择性表达的结果。为了鉴定参与鱼类早期胚胎发育和胚层分化的调控因了,分别构建了银鲫(Carassiusauratusgibelio)原肠胚和成熟卵子的SMARTcDNA文库,并采用差异筛选的方法,从银鲫原肠胚SMARTcDNA文库中筛选不同于成熟卵子的差异表达基因。通过菌斑和PCR产物的两轮斑点杂交,从大约1500个克隆中筛选出131个阳性克隆,从中选择58个克隆测序并将测得的序列进行了数据库比对分析,结果显示这些差异表达基因大部分为参与转录和翻译的调控因子和核糖体蛋白以及一些在胚胎早期大量表达的参与脂类代谢的脂蛋白和一些未知的新基因。接着采用RTPCR技术,对其中6个基因在胚胎发育不同阶段的表达特征进行了分析,进一步证实这些基因在胚胎发育过程中存在表达差异;研究还从分析的基因中揭示出4类不同的表达模式。通过本研究,已筛选出一批在银鲫胚胎发育早期开始表达的调控基因,为开展鱼类胚胎发育早期表达基因的功能研究奠定了前期工作基础。       

差异表达基因分离技术的研究进展

分离并克隆差异表达基因是生命科学的研究热点.近年来,以差示筛选、扣除杂交等基本方法为基础,先后出现了抑制差减杂交,微阵列技术等多种分析差异表达基因的技术, 使差异表达基因分离方法不断完善.对这些方法的优缺点、发展趋势及应用前景进行了简要综述.     

抑制消减杂交技术的原理及应用

基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动,对这些差异表达基因进行分离、克隆有助于了解人体各项生命活动的分子调控机制。抑制硝减杂交技术是新建立的一个快速克隆差异表达基因ｃＤＮＡ的有效方法。本将详细介绍该技术的原理及应用。     

兔植入前移核胚中发育相关基因的差异表达分析

与早期胚胎发育相关的一些重要基因异常表达致使克隆胚细胞核的再程序化过程受阻,是导致动物克隆失败的重要原因.为了分离鉴定再程序化相关基因,我们改进了mRNA差异显示技术,成功地建立了单胚差示技术体系.以不同发育时期的兔克隆胚（MⅡ卵、2细胞、4细胞、8～16细胞克隆胚胎）为材料进行单胚差示, 分离了80个差异片段.经反向RNA印迹验证、亚克隆、序列分析及NCBI GenBank数据库检索, 结果表明：A028片段与CstF3基因有93％的同源性, 在早期胚胎发育过程中的表达有阶段特异性, 该基因在兔克隆胚的早期发育过程中起重要作用.RNA印迹显示：该基因在所检测的组织中,只在卵巢中有表达.这项研究为再程序化相关基因全长的克隆及功能研究奠定了良好的基础.     

鲤鳞被SLC25A5基因的克隆和表达分析

本研究利用差异表达技术(Genefishing)在德国镜鲤和建鲤两个皮肤中表达差异,分离和克隆了鲤鱼鳞被相关的基因,溶质载体蛋白基因SLC(Solute Carrier Protein)大家族中SLC25基因小家族,通过克隆测序的序列在NCBI中比对结果分析,和SLC25家族中的SLC25A5基因结构非常相似,同源性达到9 9%。     

红麻MYB21基因的克隆、表达及载体构建

克隆红麻不育系和保持系的MYB21基因,分析MYB21基因在红麻不育系和保持系各器官的表达量,并构建过表达载体和RNAi载体,旨在为进一步研究该基因在红麻中的功能奠定基础。以同源克隆的方法克隆MYB21基因;用实时荧光定量的方法分析MYB21基因在红麻不育系和保持系不同组织器官的表达模式;根据酶切-连接的方法,构建过表达载体和RNAi载体。结果显示,红麻MYB21基因在不育系和保持中的基因序列没有差异,其c DNA全长序列为922 bp,包含843 bp的开放阅读框,DNA全长序列为1 108 bp,包含3个外显子和2个内含子(NCBI序列登录号为KT898146);MYB21基因主要在花药中表达,在不育系和保持系花药之间表达量呈极显著差异;成功构建MYB21过表达载体和RNAi载体。成功克隆MYB21基因的全长序列;实时荧光定量结果表明MYB21基因主要在花药中进行表达;构建的植物过表达载体PBI121-MYB21和RNAi载体p ART27-PK-R1-F2可用于该基因的功能研究。     

鉴别差异表达基因的新方法──抑制消减杂交法(SSH)

抑制消减杂交法（SuppressicSubtractiveHybridization,SSH）是最近（1996）报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法［1,2］。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如mRNA差别显示法（DDRT－PCR）、代表性序列差异分析（RDA）比较,认为SSH方法具有高效快速、高敏感性和假阳性低等优点。同时,625个克隆中有很大一部分是转录物丰度很低的基因,40％的克隆可能为新的基因。因此,SSH可作为鉴别差异表达基因和克隆新基因的有效方法。     

小伞山羊草中新型avenin-like基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆小伞山羊草中新型avenin-like（类燕麦储藏蛋白）基因,揭示avenin-like基因的表达模式,并构建avenin-like基因真核胚乳特异性表达载体。方法：利用RT-PCR方法揭示avenin-like基因的表达模式,并用PCR方法从小伞山羊草中克隆新型avenin-like基因;将克隆的avenin-like基因插入表达载体pLRPT构建真核表达载体pLRPT-avel,并经酶切和测序鉴定。结果：avenin-like基因在胚乳中特异性表达;克隆得到新型avenin-like基因,并构建了其真核胚乳特异性表达载体。结论：新型avenin-like基因的克隆及其真核表达载体的构建,为小麦品质改良提供了研究基础。     

ＥＳＴ在克隆新基因中的应用

随着基因定位（连锁图谱、物理图谱、转录图谱）和ＤＮＡ测序及生物信息技术的迅猛发展,ＥＳＴ已成为人类寻找新的未知基因以及克隆不同时空差异表达基因和疾病相关基因的重要标志物。随着ＥＳＴ数据库的进一步完善,网上克隆和定位候选克隆策略将成为克隆新基因的主要方法,并在虚拟的网上空间将模型生物基因组的研究成果成功地应用于人类基因组的研究中。     

兔胚胎时期特异性基因相关新片段的克隆

阶段特异性基因的表达是早期胚胎发育过程中的重要事件,对植入前胚胎基因表达模式的研究是进一步研究植入前胚胎发育调控机制的前提。本实验利用mRNA差异显示技术来研究兔(Oryctolagus cuniculus domestica)植入前各期胚胎的基因表达差异。在获得的42个阳性阶段特异性表达的基因中,有5个在NCBI和EMBL数据库中没有同源序列,登录EMBL,申请了登录号。这些新基因片段都是桑葚期特异表达的基因,而且在以后的囊胚期也有表达。兔由母源型调控向合子型调控的过渡是在8～16细胞期开始的,在桑葚期开始表达的这些基因片段应该是兔胚胎时期特异性基因。这些基因的克隆将为进一步研究兔的植入前胚胎发育模式奠定基础。     

一个在肺腺癌细胞系中差异表达cDNA片段的定位及表达分析

为了研究和克隆肺癌转移相关候选基因,探讨肺癌发生及转移的分子基础,应用细胞培养,cDNA克隆,Noorthern印记杂交和生物信息学技术分析了在细胞来源相同,但转移能力不同的肺腺癌细胞系AGZY83－a和Anip973中差异表达片段OPB7－1在人不同组织中和不同人肺癌细胞系中的表达情况,并应用RH定位技术对该片段进行了基因定位。表明OPB7－1与已知基因同源性差,该基因在正常人多种组织中有表达,心肌和骨骼肌中高表达,转录本均为3.0kb左右。在不同人肺癌细胞系中存在该基因的表达差异,高转移潜能,低分化及高浸润的细胞系中呈高表达趋势,且表达的片段大小略有差别。提示OPB7－1是一个具有广泛表达为的基因,可能是与肺癌的发生发展相关的新基因。     

广西巴马小型猪SLC30-A8基因克隆及组织表达差异分析

本研究的目的是克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因,并确定各组织的表达量。利用RT-PCR的方法扩增并克隆SLC30-A8基因;荧光定量PCR检测SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、小肠和脂肪中的表达。结果显示,成功克隆广西巴马小型猪SLC30-A8基因CDS区全长1 110 bp,荧光定量PCR结果显示SLC30-A8基因在12月龄广西巴马小型猪胰腺组织中表达量最高,其次是心脏、脾脏,在肺脏、小肠以及脂肪组织中几乎不表达。本研究成功克隆了广西巴马小型猪SLC30-A8基因并确定在胰腺组织中表达最高。该研究将为下一步研究SLC30-A8基因在糖尿病的发生过程中对糖代谢的作用奠定基础。     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

Xist基因抑制对牛SCNT早期胚胎发育的影响

Xist是与X染色体失活相关的非编码基因,它在合子期基因组开始表达,是胚胎发育早期表达的第一个印记基因。探讨了特异性抑制Xist的TALER-REPRESSOR(TALER)载体转染到胎牛成纤维细胞对Xist基因的抑制作用,并以抑制Xist基因表达的细胞作为核供体制作克隆胚胎,研究Xist基因抑制对牛克隆胚早期发育的影响。结果显示,与对照组细胞相比,TALER载体将Xist相对表达量下调了93.85%,说明本试验设计的载体转染系统能够有效抑制Xist基因的表达。选取Xist抑制表达阳性的转染细胞用于体细胞核移植试验,克隆胚胎发育结果显示,试验组和对照组的卵裂率、8细胞发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率分别为78.8%vs 75.1%(P0.05,无显著差异)、54.4%vs 50.6%(P0.05,无显著差异)、12.3%vs 27.8%(P0.01,差异极显著)、0 vs 26.6%(P0.01,差异极显著)。综上所述,试实验设计的特异性抑制Xist表达的TALER载体可有效抑制雌性胎牛成纤维细胞中Xist的表达。供体细胞Xist这种基因下调可使克隆胚胎2-8细胞率略有提升,但囊胚期和桑葚胚率明显降低。因此,其机制尚待于进一步探讨。     

一种简单快速克隆IL-6信号转导相关基因的方法

细胞因子作用于受体时的一个重要结果是诱导基因表达。为了克隆与IL-6诱导相关的基因,我们利用一个快速的改良DD-PCR方法,分离并检测了IL-6诱导和未诱导的U937细胞的差异表达基因。用三个完全变性的6—mer引物进行反转录,用2或3个较长的随机引物进行PCR扩增,扩增产物很在2%琼脂糖凝胶电泳上分离,之后回收差异片段并直接用于克隆和测序。在研究中,获得了7个不同的EST,序列分析表明其中2个EST可能是与细胞信号转导相关的新基因片段;反向Northern杂交证实它们是与IL-6作用相关的差异表达基因。     

卡尼鄂拉蜂锌转运蛋白-7相似蛋白（ZnT-7-like）的基因克隆、 抗体制备及差异表达

【目的】本研究旨在克隆卡尼鄂拉蜂Apis mellifera carnica锌转运蛋白 7相似蛋白（zinc transporter 7-like, ZnT-7-like）基因, 制备ZnT-7-like多克隆抗体, 了解该基因在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的差异表达情况。【方法】运用RT PCR法从卡尼鄂拉蜂王浆腺总RNA中扩增ZnT-7-like基因, 进行生物信息学分析, 为避开跨膜结构的干扰, 选择克隆其部分序列（273 bp）作为多肽免疫序列。将其亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中诱导表达获得融合蛋白, 然后将融合蛋白纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 分别用间接ELISA和Western blot检测抗体的效价和特异性, 最后采用实时荧光定量RT-PCR以及Western blot技术检测该基因在不同日龄成虫王浆腺中的相对表达量。【结果】克隆得到卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 大小为1 065 bp。SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白成功表达; 制备的多克隆抗体效价高达1∶64 000, 且具有很高的特异性。ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂5个日龄成虫中的转录情况存在较大差异, 表现为3日龄成虫中的表达量极显著高于其他日龄（P<0.01）, 12日龄表达量最低, 其他日龄间表达量两两差异显著(P<0.05)或极显著（P<0.01）; ZnT-7-like蛋白表达与转录水平基本一致。【结论】成功克隆了卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因, 制备了兔抗蜂ZnT-7-like多克隆抗体, 并在转录和翻译两个水平上测定了ZnT-7-like在卡尼鄂拉蜂王浆腺中不同时期的相对表达量。这些结果为深入研究卡尼鄂拉蜂ZnT-7-like基因的功能奠定了基础。     

中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱

【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins, OBPs）参与气味分子的识别,在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。本研究旨在克隆中华蜜蜂 Apis cerana cerana OBP3基因,以制备多克隆抗体。【方法】运用RT-PCR技术从中华蜜蜂头部总RNA中扩增OBP3基因,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)中诱导表达获得融合蛋白质,融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性,并采用荧光定量PCR检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357）,大小为444 bp。 SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。制备的多克隆抗体效价高于1∶40 000,且具有很高的特异性。荧光定量PCR结果表明,AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P<0.01）,胸部中次之（P<0.01）,头部和腹部中显著低表达,后两者表达量差异不显著（P>0.05）。【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达,并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体,为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础 。