甘蓝型油菜的遗传转化

甘蓝型油菜的各种外植体经遗传转化、组织培养后可以再生为转基因植株,但再生频率会因外植体的基因型、年龄、培养基添加成分和农杆菌共培养的不同而发生变化。转化方法包括农杆菌介导转化、基因枪法、花粉介导法、PEG介导法等,其应用前景非常广阔。甘蓝型油菜的遗传转化在其品质改良、抗逆性提高、雄性不育系的获得和一些特殊性状方面都取得了很大成就。简要介绍甘蓝型油菜的再生体系建立、转化方法及所取得的部分成就。     

烤烟栽培品种G28和K326抗黄瓜花叶病毒的遗传转化

采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将ＣＭＶＢＳ（香蕉株系）的ＣＰ基因转入广东烤烟栽培品种Ｇ２８和Ｋ３２６,获得了再生转基因烟株。在卡那霉素（Ｋｍ）１００μｇ／ｍＬ浓度下转化体叶片分化形成愈伤组织;用ＰＣＲ和ＤＡＳＥＬＩＳＡ分析,结果证明ＣＰ基因已整合到转化烟株的染色体中,并得到不同程度的表达。利用广东地区香蕉、烟草和番茄上的ＣＭＶＢＳ、２７和３７株系,采用机械接种和蚜虫传毒法分别进行攻毒试验,结果证明转基因烟株对这三个株系的攻击都表现出明显的抗病能力,其抗性程度与烟株中的ＣＰ表达量呈正相关。采用五种攻毒浓度处理,发现随着攻毒浓度的增加,转基因烟株的抗病能力逐渐减弱。     

双价抗虫基因陆地棉转化植株的获得

利用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＳｍｉｔｈｅｔＴｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）介导法将含有豌豆外源凝集素（ｐｅａｌｅｃｔｉｎ,ＰＬｅｃ）基因和大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂（ｓｏｙｂｅａｎＫｕｎｉｔｚｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＳＫＴＩ）基因的双价抗虫基因植物表达载体ｐＢｉｎＬＫ用于陆地棉（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）栽培品种“新陆早１号”、“新陆中２号”、“冀合３２１”和“辽９”的转化。棉花无菌苗下胚轴经过与根癌农杆菌共培养、卡那霉素抗性愈伤组织的筛选、体细胞胚状体的诱导和植株再生等阶段成功地获得了双价抗虫基因陆地棉转化植株。ＮＰＴⅡ的ＥＬＩＳＡ检测、ＰＣＲ鉴定和ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ检测证实,两个外源抗虫基因同时存在于再生植株基因组内。抗虫测试结果表明,转基因棉株对棉铃虫（ＨｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａＨｕｂｎｅｒ）幼虫具有较强的抗性     

根癌农杆菌介导的水稻转化及转基因R1代植株表型特征

用根癌农杆菌介导的方法对２ 个粳稻品种和４ 个籼稻品种进行了转化。粳稻成熟胚和籼稻幼胚来源的愈伤组织用携带质粒ｐＧＩＨ 的农杆菌ＥＨＡ１０１ 感染,对所有品种均获得较高的愈伤转化频率（２０．８３ ％ ～６２ ．３２ ％ ） 。粳稻“申香粳４ 号”植株转化频率为１７ ．３９ ％ ,“秋丰”为９ ．２１％ 。４ 个品种籼稻中仅“超丰早１ 号”获得１ 株转化植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析、ＧＵＳ 染色、ＴＤＮＡ 整合边界序列分析等结果表明外源基因整合入植物基因组中。对Ｒ１ 代分析结果表明外源基因能遗传给后代,大多数株系的分离比符合３∶１ ,也有少数株系分离比异常。对转基因Ｒ１ 代水稻植株表型特征分析结果显示转化植株株高下降,每株分蘖数减少,每株籽粒数明显减少,部分植株播种至开花所需时间延迟。     

农杆菌GV3101中反式玉米素合成基因促进烟草再生

胭脂碱型农杆菌GV3101已经被广泛用于植物遗传转化研究。已有的研究结果证明,农杆菌GV3101株系含有的反式玉米素合成 (trans-zeatin synthesizing,tzs)基因编码产物会影响烟草细胞器的形态及细胞的生理状态。然而,有关tzs基因对遗传转化过程外植体再生的影响研究却少有报道。本文在前期研究工作的基础上,以2种烟草、4个农杆菌株系为组培实验材料,验证了胭脂碱型农杆菌tzs基因产物的生理活性。结果表明：以外源添加生长调节物质的外植体为阳性对照,在不添加任何生长调节剂的培养基上,与GV3101菌株共培养的烟草外植体能分化再生,并发育成完整植株;外植体再生与GV3101携带的质粒种类无关;外植体与农杆菌GV3101培养液共培养24 h,烟草再生效果较好;与GV3101株系共培养24 h,将外植体烟草叶片匀浆,经亲和柱分离纯化后,检测出烟草外植体叶片中高达0.78 ng/g FW-1的反式玉米素含量。菌落PCR扩增结果证实,农杆菌GV3101株系有tzs基因序列。以上结果表明,农杆菌GV3101株系内的tzs基因的表达产物有生理学活性,能够促进烟草外植体再生,调节细胞生长。     

抗除草剂草甘膦EPSPs基因在小麦中的转化

通过基因枪法,用抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因转化小麦京花１号的幼穗约１０００个,及幼胚约８００个,经草甘膦选择后分别获得３８株和４株再生植株。这些再生植株经ＰＣＲ和（或）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,其中有部分再生植株的基因组中稳定整合了外源ＥＰＳＰｓ基因,并且转化体中部分是可育的。首次用实验证明,抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因作为单子叶禾谷类作物小麦基因转化的选择标记是行之有效的。     

农杆菌GV3101中反式玉米素合成基因促进烟草再生北大核心CSCD

胭脂碱型农杆菌GV3101已经被广泛用于植物遗传转化研究。已有的研究结果证明,农杆菌GV3101株系含有的反式玉米素合成(trans-zeatin synthesizing,tzs)基因编码产物会影响烟草细胞器的形态及细胞的生理状态。然而,有关tzs基因对遗传转化过程外植体再生的影响研究却少有报道。本文在前期研究工作的基础上,以2种烟草、4个农杆菌株系为组培实验材料,验证了胭脂碱型农杆菌tzs基因产物的生理活性。结果表明:以外源添加生长调节物质的外植体为阳性对照,在不添加任何生长调节剂的培养基上,与GV3101菌株共培养的烟草外植体能分化再生,并发育成完整植株;外植体再生与GV3101携带的质粒种类无关;外植体与农杆菌GV3101培养液共培养24 h,烟草再生效果较好;与GV3101株系共培养24 h,将外植体烟草叶片匀浆,经亲和柱分离纯化后,检测出烟草外植体叶片中高达0.78 ng/g FW-1的反式玉米素含量。菌落PCR扩增结果证实,农杆菌GV3101株系有tzs基因序列。以上结果表明,农杆菌GV3101株系内的tzs基因的表达产物有生理学活性,能够促进烟草外植体再生,调节细胞生长。     

根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植的再生

用根癌农杆菌共培养法把外源基因导入甘蓝型油菜主要栽培品种“云北２号”,获得转基因植株。所用外植体为带有１－２ｍｍ子叶柄的完整子叶,根癌农杆菌为Ａ２０８ＳＥ（ｐＴｉＴ３７－ＳＥ,ｐＲＯＡ９３）。Ｔｉ质粒ｐＲＯＡ９３带有ＮＰＴⅡ及ＧＵＳ嵌合基因。共培养２天后转到附加２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的分化培养基（ＭＳ＋４．５ｍｇ／ＬＢＡＰ）上。ＡｇＮＯ３和羧苄青霉素促进芽的分化,头孢霉素则有抑制作用。最高转化频率为     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因…

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ｔｉ质粒转化材料,利用共培养法将苏云杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现：８００μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可转将化效率提高５０倍。     

黄瓜花叶病毒（CMV）运动蛋白基因介导的抗病性

利用Ｆｎｙ＿ＣＭＶ株系ＲＮＡ３ｃＤＮＡ克隆,构建了含有全长和编码区缺失５０１个核苷酸的运动蛋白（ＭＰ）基因植物表达载体ｐＢＭＰＲ和ｐＢＭＰＫ。在土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＳｍｉｔｈｅｔＴｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）ＬＢＡ４４０４介导下转化烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）品种“ＮＣ８９”,分别经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ、ＲＴ＿ＰＣＲ或Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析,外源基因已整合到再生植株中并得到表达。抗病性分析表明,含有缺失型ＭＰ基因的Ｒ０代转基因植株抗性较好,接种５０ｄ后,１０株转化植株中仍有５株不表现症状。在自然发病条件下,这５个含有缺失型ＭＰ基因转基因株系在Ｒ１代都表现了一定的抗病性。抗性主要表现为症状出现推迟,严重度减轻。利用ＰＣＲ筛选、种子卡那霉素抗性试验和温室抗病性测定等方法,初步认为Ｒ２代转基因烟草Ｋ＿６＿５株系为转基因抗病纯合系。而含有全长ＭＰ基因的Ｒ０代转化植株,前期没有表现明显的抗病性,但在接种４０ｄ后部分发病植株有恢复健康的趋势。     

转抗虫基因三倍体毛白杨植株体内农杆菌残存与逃逸

用部分改造的BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂（APLA）基因构建的双抗虫基因表达载体,通过农杆菌介导法对三倍体毛白杨进行了转化,对转化后植株体内残存农杆菌在继代培养和移栽过程中进行了跟踪检测。结果表明：通过对转化再生植株的分子生物学检测,42个株系中,33个株系为阳性,阳性率达到80％;用Bt毒蛋白抗血清进行ELSA检测结果表明,7个转基因株系都有Bt杀虫蛋白表达;基因转化后,可采用附加50mg／L卡那霉素,300mg／L羧苄青霉素的筛选培养基消除细菌并进行抗性芽筛选。对28个转基因株系叶片、茎段和根段在含有卡那霉素50mg／LYEB培养基上进行细菌培养,通过在T-DNA区、质粒Vir区和农杆菌基因组设计引物,进行PCR检测,证明有3个株系（33、37、5号）检测到残存工程农杆菌,并在组培瓶中存活24个月。将带菌的3个株系组培苗移栽到花盆中,室内培养1个月后,在33号株系根际土壤中检测到了目的农杆菌。     

月季的植株再生及遗传转化研究进展

本文对近20年月季植株再生和转基因研究进展进行了较为系统的回顾和总结。月季通过器官和体细胞胚发生途径都能再生植株,但遗传转化主要是利用体细胞胚发生途径。通过农杆菌介导法和基因枪法,外源基因如报告基因、抗病基因和改变花色的基因等已转化成功。文章还对今后月季转基因研究的方向进行了讨论。     

转抗虫基因三倍体毛白杨植株体内农杆菌残存与逃逸

用部分改造的 BtCry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂(API-A)基因构建的双抗虫基因表达载体,通过农杆菌介导法对三倍体毛白杨进行了转化,对转化后植株体内残存农杆菌在继代培养和移栽过程中进行了跟踪检测。结果表明：通过对转化再生植株的分子生物学检测,42个株系中,33个株系为阳性,阳性率达到80％;用Bt毒蛋白抗血清进行ELSA检测结果表明,7个转基因株系都有Bt杀虫蛋白表达;基因转化后,可采用附加50 mg/L卡那霉素,300 mg/L羧青霉素的筛选培养基消除细菌并进行抗性芽筛选。对28个转基因株系叶片、茎段和根段在含有卡那霉素50 mg/L YEB培养基上进行细菌培养,通过在T-DNA区、质粒Vir区和农杆菌基因组设计引物,进行PCR检测,证明有3个株系（33、37、5号）检测到残存工程农杆菌,并在组培瓶中存活24个月。将带菌的3个株系组培苗移栽到花盆中,室内培养1个月后,在33号株系根际土壤中检测到了目的农杆菌。     

抗芜菁花叶病毒转基因甘蓝型油菜的研究

以子叶柄为材料,建立了甘蓝型油菜（ＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）双低品种的再生体系。通过子叶柄与农杆菌（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４）共培养,将表达载体ｐＢＴｕ中芜菁花叶病毒外壳蛋白（ＴｕＭＶ－ＣＰ）基因以整合方式导入甘蓝型油菜,然后用卡那霉素进行筛选,获得了油菜再生植株。经ＰＣＲ特异性扩增、点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,证明再生植株基因组ＤＮＡ中整合了ＴｕＭＶ－ＣＰ基因。攻毒实验表明,有ＴｕＭＶ－ＣＰ基因插入的工程油菜对ＴｕＭＶ均有不同程度的抗性。     

利用转基因生物技术防御水稻东格鲁病毒

《ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ》１９９９年５卷２期１７７～１８５页报道：美国蒙大拿州立大学植物学与土壤和环境科学系的科学家Ｓｉｒａｍａｎｉ等利用粒子轰击法将水稻东格鲁球状病毒（ＲＴＳＶ）的衣壳蛋白（ＣＰ）基因ＣＰ１、ＣＰ２和ＣＰ３个别或共同引入籼稻和／或粳稻细胞。再通过ＲＴＳＶ的天然传播媒价二点黑尾叶蝉将ＲＴＳＶ接种于原始转化体的自交后代植株。ＲＮＡ印迹分析表明,在含有目标基因的１９个选育转基因水稻株系中的１６个株系及其Ｒ１、Ｒ２和／或Ｒ３后代中积累了嵌后ＣＰ基因的转录本。还发现,个别或共…     

紫云英细胞转化条件的研究

研究了紫云英（ＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｉｎｉｃｕｓＬ．）细胞遗传转化的条件。根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）经含乙酰丁香酮的低ｐＨ／ＰＯ３－４ 诱导培养后,用来感染紫云英下胚轴原生质体,随后的细胞ＧＵＳ瞬间表达活性显著提高,间接证明了上述预培养诱导活化了细菌ｖｉｒ基因,促进了Ｔ－ＤＮＡ 向植物细胞转移。在ＰＥＧ介导的ＤＮＡ 转移中,较高的ｐＨ 和Ｃａ２＋ 浓度能够提高细胞ＧＵＳ活性。质粒ＤＮＡ 浓度及启动子类型对外源基因在植物细胞内表达也有一定影响。采用外植体－农杆菌共培养法,获得ＧＵＳ和ＮＰＴ Ⅱ基因稳定表达的紫云英转化植株     

甘蓝型油菜抗虫转基因植株及其抗性分析

通过油菜子叶外植体－农杆菌共培养法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜,获得抗虫的转基因植株。带有１￣２ｍｍ子叶柄的油菜子叶经农杆菌感染后,共培养２￣３天,然后转移到附加１５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＭＳ选择培养基上筛选转化愈伤组织及不定芽。卡那霉素抗性苗相继在含２０￣５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的选择培养基上继代培养,再转移到含２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的生根培养基上诱导生根。以苏云金杆菌杀虫蛋白基因为探针,进行１     

基因枪法和农杆菌介导法对水稻转基因拷贝数的基因重排概率的影响

基因枪法和农杆菌介导法转化的外源DNA整合到植物梁色上是随机进行的,因此,它们可能会产生不同的转基因拷贝数,得到不同的基因表达盒完整率,这反过来会影响基因的表达,为证实这一假说,作首先将同一质粒pAcPG-CAM分别用基因枪法和农杆菌介导法转化到水稻（Oryza sativa L.cv.TNG67)愈伤组织,为了揭示不同质粒是否也出现类似结果,也用农杆菌介导法,基因枪法分别将pTOK233和pJPM44导入水稻愈伤组织,并获得一批转基因植株,Ｒ０代值转基因表达的分析用ＧＵＳ组织化学染色法,用质粒上的单切点酶酶切基因组DNA后的Southern杂交结果确定转基因拷贝数,总DNA髟双切点酶（分别位于表达盒两侧）酶切后的Southern杂交结果确定了完整转基因表达盒数目,结果表明,农杆菌介导转化法的转基因植株的转基因拷贝数相对少一些（平均为2．1和2．3）,而基因枪法转化产生的转基因植株的转基因撬贝数相对多一些（平均为4．2和5．6）,并且农杆菌介导转化法的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率低于由基因枪法转化产生的转基因植株的基因表达盒DNA重排概率－农杆菌介导转化法的DNA重排概率为0．07和0．106,由基因枪法转化的DNA重排概率为0．57和0．66。研究还分析了基因表达情况与转基因的拷贝数或完整表达盒数之间的关系,GUS定量分析结果表明,为了准确揭示转基因的表达情况与转基因之间的关系,用完整基因表达盒数而不是转基因DNA拷贝数更准确,并于用不同转基因方法将同种质粒导入植物体分析基因表达盒DNA重排概率为首次报道。     

Transgeni根癌农杆菌介导的小麦转基因植株再生(英文)

根癌农杆菌菌株Ａｇｌ Ⅰ的Ｔｉ 质粒ｐＵＮＮ－２ 带有Ｕｂｉ１ 启动子驱动的ｎｐｔ Ⅱ基因。７ 种基因型小麦幼胚或胚性愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。经过不同浓度巴龙霉素的筛选,３ 种基因型小麦产生抗性愈伤组织并再生植株。再生植株经ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交鉴定为转基因植株,转化频率（ 再生转基因植株的小麦愈伤组织数／ 用于转化实验的愈伤组织数） 为３．７％ ～５ ．９％ 。小麦基因型及转化材料的起始生理状态是影响ＴＤＮＡ转移的重要因素。     

根癌农杆菌介导的小麦转基因植株再生

根癌农杆菌菌株Ａｇｌ Ⅰ的Ｔｉ质粒ｐ＾ＵＮＮ－２带有Ｕｂｉ１启动子驱动的ｎｐｔⅡ基因。７种基因型小麦幼胚或胚性愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。经过不同家度巴龙霉素的筛选,３种基因型小麦产生抗性愈伤组织并再生植株。再生植株经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定为转基因植株,转化频率为３．７％－５．９％。小麦基因型及转化材料的起始生理状态的影响Ｔ－ＤＮＡ转移的重要因素。