白细胞介素6重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性过表达大鼠IL-6基因的重组逆转录病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾HEK293细胞中检测IL-6的表达。方法以大鼠骨髓间充质干细胞mRNA为模板,经PCR获得目的基因IL-6,将其定向克隆到逆转录病毒载体pSEB-3H中,构建重组逆转录病毒质粒pSEB—IL-6,经脂质体分别转染到PC12细胞和HEK293细胞中,应用Real—timePCR和ELISA的方法在mRNA和蛋白质水平检测IL-6的表达变化。继而用HEK293细胞中包装获得的含有pSEB—IL-6的病毒颗粒进一步感染PC12细胞,Real—timePCR检测,IL-6mRNA的表达水平变化。结果PCR电泳及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒载体中,其基因序列与Genbank报道一致;Real—timePCR和ELISA结果均显示,逆转录病毒质粒pSEB—IL-6转染PC12细胞和HEK293细胞后,IL-6的表达水平较对照组显著上调;经pSEB—IL-6逆转录病毒颗粒感染的PC12细胞中,IL-6mRNA表达水平较对照组提高4倍。结论成功构建了特异性表达大鼠儿-6基因的重组逆转录病毒载体pSEB—IL-6,并获得了具有感染能力的逆转录病毒颗粒,感染真核细胞后可高表达IL-6,为进一步研究IL-6的功能及其在多种疾病中的免疫调节机制提供重要的分子手段。     

结核分枝杆菌抗原重组酿酒酵母免疫诱导小鼠特异性免疫应答

近年来基于重组酿酒酵母全细胞的新型疫苗研究报道不断出现。以结核杆菌重要保护抗原ESAT6和Ag85B为对象,采用pHR酿酒酵母表达系统,构建了两种分别表达ESAT6-Ag85B(EA)和IFN-γ-ESAT6-Ag85B(IEA)融合抗原的重组酿酒酵母Yeast-EA和Yeast-IEA。重组酵母以皮下注射方式免疫小鼠后,小鼠产生高水平Ag85B特异性抗体,淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子,无IL-4产生,发生Th1型细胞免疫应答,其中Yeast-IEA效应更强,优于传统的BCG疫苗。实验证实重组酵母能够刺激树突状细胞的成熟分化。研究结果显示结核分枝杆菌抗原重组酿酒酵母全细胞疫苗具有发展成为新型抗结核疫苗的潜力。     

猪IL-18 在杆状病毒/昆虫细胞中的表达

IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用。将重组质粒转染昆虫细胞,SDS-PAGE可检测到分子量为18 kDa左右的重组蛋白,Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-18抗体发生特异性反应。纯化后蛋白能明显促进猪T淋巴细胞转化,表明所表达的IL-18具有较高的生物活性。此研究为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。     

脑缺血再灌注小鼠M1极化的小胶质细胞分泌的可溶性Robo4对血脑屏障完整性的破坏作用

本文旨在研究缺血再灌注过程中小胶质细胞的极化对血脑屏障的调控作用和机制。构建脑缺血再灌注的小鼠模型后,小鼠外周血中IL-6、TNF-α表达明显升高,脑组织中IL-6和iNOS mRNA表达增加,iNOS的蛋白表达水平增加,小胶质细胞呈现出明显的M1极化趋势。在体外对脑小胶质细胞Bv-2进行糖氧剥夺后复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)处理,在细胞培养上清中检测到TNF-α、IL-6表达明显上升,细胞内IL-6、iNOS和CD86 mRNA表达增加,IL-6和i NOS蛋白表达增加。RNAseq检测结果显示,诱导M1极化的Bv-2细胞和OGD/R处理的Bv-2细胞中Robo4 (roundabout guidance receptor4)的表达都显著增加。进一步研究发现M1极化的Bv-2细胞和OGD/R处理的Bv-2细胞外泌可溶性Robo4蛋白(soluble roundabout guidance receptor 4, sRobo4)也显著增加,并且Robo4重组蛋白、M1极化Bv-2细胞培养上清或OGD/R处理的...     

西方马脑炎核酸疫苗表达载体构建及免疫原性研究

为构建西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)结构基因C-E3-E2-6k-E1重组真核表达载体,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性.采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-C-E,用酶切和测序分析方法鉴定正确后,重组质粒被转染到293T细胞,经电镜检测和间接免疫荧光方法证明基因可以表达后,用该重组质粒免疫小鼠,免疫后检测实验组小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和血清中细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度,以上实验组各项免疫指标与对照组相比差异均显著(P＜ 0.05);ELISA方法检测实验组小鼠血清中WEEV的IgG抗体效价是1∶16.研究结果表明重组质粒pcDNA3.1-C-E可在细胞中获得瞬时表达,并且重组质粒作为核酸疫苗能够刺激小鼠产生免疫反应,具有较强免疫原性,为今后WEEV核酸疫苗研制奠定了良好基础.     

树鼩白细胞介素6的原核表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆树鼩白细胞介素6(IL-6)基因,在大肠杆菌中高效表达、纯化,并鉴定免疫原性。方法:根据GenBank预测的树鼩IL-6基因序列设计引物并扩增基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建的重组表达质粒pET-30a(+)-IL-6转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达;表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IL-6的分布情况。结果:酶切及测序证实重组表达质粒pET-30a(+)-IL-6构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29×10~3,纯化后复性的重组蛋白纯度可达95%以上,免疫兔子后Western印迹和ELISA鉴定其具有免疫原性,在气管、心、脾、肾中能检测到IL-6。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IL-6,纯化复性后具有良好的免疫原性。     

重组白细胞介素-2纯化过程中影响活性的因素探讨

<正> 白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)是一种重要的免疫调节剂,具有促进T细胞增殖和分化,调节NK细胞活性,诱导LAK等功能,在肿瘤治疗上有广泛的应用前景。我们的前文就重组菌中IL-2包含体的制备、性质及重组rIL-2的纯化进行了研究,本文就重组rIL-2纯化过程中影响其活性的有关因素进行了探讨。     

草鱼IL-10单克隆抗体的制备与鉴定

白细胞介素10(Interleukin-10, IL-10)参与机体免疫应答调节, 协同其他细胞因子维持免疫系统稳态。为探究草鱼(Ctenopharyngodon idella)IL-10的细胞来源, 研究利用大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)表达系统制备了高纯度的草鱼IL-10重组蛋白, 免疫小鼠制备单克隆抗体后通过免疫印迹、激光共聚焦和流式细胞术对抗体进行分析。结果表明, 获得的单克隆抗体不仅能特异识别大肠杆菌表达的CiIL-10重组蛋白, 而且能识别HEK293细胞中表达的真核IL-10重组蛋白。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和草鱼白细胞介素1β(IL-1β)刺激草鱼性腺细胞系(GCO)36h的免疫荧光染色分析表明, 草鱼IL-10单克隆抗体能与草鱼内源IL-10结合, 但IL-10阳性细胞数量在LPS处理前后无明显变化。该研究成功制备了高纯度CiIL-10重组蛋白, 获得了特异性好的高质量单克隆抗体, 为研究草鱼ILC2和Th2细胞的增殖、分化和功能奠定了基础。     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

重组小鼠白细胞介素-33的原核表达制备及其粘膜免疫佐剂活性

目的:白细胞介素(IL)-33对树突状细胞、巨噬细胞及T细胞等免疫细胞具有重要调控作用。利用大肠杆菌制备重组小鼠的IL-33,并初步考察其作为粘膜免疫佐剂应用的潜能与特点。方法:以IPTG诱导硫氧还蛋白(Trx)/IL-33融合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达,并通过QSepharose离子交换和Ni~(++)金属螯合亲和层析纯化Trx/IL-33,进一步经肠激酶切割获得成熟形式的IL-33。重组HBcAg混合纯化的IL-33后经滴鼻免疫小鼠,考察HBcAg特异的IgA及IgG_1、IgG_(2a)的应答。结果:纯化的重组IL-33具有与标准品相当的促巨噬细胞RAW264.7表达TNF-α的体外细胞生物学活性。作为佐剂可显著增强滴鼻粘膜免疫激发的不同粘膜组织中HBcAg特异的IgA应答,以及血清与支气管肺泡灌洗液中特异IgG_1的应答水平,而抑制IgG_(2a)应答。结论:利用大肠杆菌可制备活性IL-33,其具有粘膜免疫佐剂的应用潜能。     

猪白细胞介素2与融合白细胞介素4/6基因共表达的免疫效应研究

目的构建猪融合白细胞介素4/6与猪白细胞介素2基因的共表达载体,研究其共表达对小鼠免疫的协同效应。方法以2A自剪接技术首次构建猪融合白细胞介素4/6与白细胞介素2基因的共表达重组质粒,以壳聚糖纳米材料包裹制成纳米颗粒,进行体外转染HEK293细胞,提取总RNA进行RT-PCR分析,最后肌肉注射小鼠进行体内实验并分析。结果成功构建了重组共表达质粒VRIL4/6-2;壳聚糖包裹后转染HEK293细胞,48 h后收集细胞,RT-PCR检测显示目的基因能够在HEK293细胞中高效地转录与表达。小鼠接种实验结果表明,实验组血清中的IgG和IgG2a的含量比对照组显著增加,并且VRIL4/6-2-CS接种组的小鼠体液免疫水平明显增高(P0.05);VRIL4/6-2实验组的CD4+淋巴细胞显著多于其它实验组(P0.05);实验组IL-2、IL-4、IL-6、IL-23基因的表达水平明显高于对照组(P0.05),实验组小鼠外周血白细胞、血小板和血红蛋白的含量均显著高于对照组(P0.05)。结论 VRIL4/6-2共表达质粒能够更好的增强动物体液免疫和细胞免疫机能,可作为提高动物体液免疫和细胞免疫的经济高效安全新型免疫调节剂,具有潜在的重要应用前景。     

S100A6通过巨噬细胞促结直肠癌细胞增殖的作用及机制

目的:探讨微环境中钙周期素S100A6是否通过影响巨噬细胞(macrophages,M_φ)进而促进结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞的增殖及其机制。方法:制备(原核表达)并鉴定带GST(glutathione S-transferase,谷胱甘肽S-转移酶)标签的人重组S100A6蛋白(recombinant GSTh S100A6,r S100A6)和对照蛋白GST;采用台盼兰计数、CCK8和结晶紫染色检测CRC细胞系HCT116的增殖能力;用定量实时聚合酶链反应检测M_φ中IL-6 mRNA水平;用Western blot检测M_φ中IL-6的蛋白水平、HCT116细胞中JAK2和STAT3及其磷酸化水平。结果:(1)成功制备r S100A6和GST蛋白。(2)与经r S100A6处理的M_φ(即A6-M_φ)共培养后,HCT116细胞的增殖能力增强(P 0. 05);同时,HCT116细胞中的JAK2和STAT3水平无明显变化,但其磷酸化水平提高(P 0. 05)。(3) A6-M_φ中,IL-6的mRNA和蛋白水平均升高(P 0. 05)。(4)在HCT116与A6-M_φ的共培养体系中加入IL-6R封闭肽后,A6-M_φ促HCT116细胞的活力和增殖能力的作用被部分逆转(P 0. 05)。结论:微环境中的S100A6可通过上调巨噬细胞中IL-6的表达、进而激活HCT116细胞中IL-6/JAK2/STAT3信号通路来促进CRC细胞的增殖。     

真核表达猪白细胞介素17及其生物活性研究

目的:为真核表达猪白细胞介素17(IL-17),研究产物在细胞培养下的免疫生物活性。方法:通过PCR扩增出猪IL-17基因并插入到真核表达载体p VAX1,然后转染到IPEC-J2细胞、Ha Ca T细胞和L02细胞中。在转染后第24、48和72h收集细胞,第48h收集上清液。收集细胞通过实时荧光定量PCR检测相关免疫基因的表达水平,收集上清液通过抑菌试验检测相关抗菌肽的生物活性。结果:采用p VAX1载体构建了表达猪IL-17的重组质粒,转染到细胞中。证实IL-17基因能诱导抗菌肽基因(RegⅢ、S100A8和BD2)的表达,显著上调JAK-STAT信号通路基因(JAK1、STAT1和STAT3)和细胞因子基因(IL-6、IL-12和TNF-α)的表达。此外,细胞上清液能够在不同程度上抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的增殖。结论:成功将猪IL-17基因真核表达,其表达产物能诱导效应细胞表达多种细胞因子,产生多种抗菌肽,具有抑菌能力;这为进一步研发猪IL-17作为抗菌免疫分子制剂奠定了初步基础。     

BMP9对人肺腺癌A549细胞侵袭、迁移的影响及机制的研究

BMP9属于TGF-β超家族的成员,参与多种细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭、转移过程。以人肺腺癌细胞A549作为目的细胞,采用腺病毒体外感染方式,外源性高表达BMP9。RTPCR及Western blot检测重组细胞中BMP9的表达,通过细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测AdBMP9细胞侵袭及迁移改变,RT-PCR及Western blot检测感染BMP9腺病毒后IL-6的mRNA和蛋白表达;Western blot检测PI3K/Akt信号通路中总Akt和磷酸化Akt蛋白的表达。结果显示:与对照组细胞相比,感染BMP9腺病毒后,A549中BMP9 mRNA和蛋白表达明显升高;实验组划痕愈合率由对照的(85.4±2.1)%与(86.5±3.4)%上升至(97.4±2.6)%(P0.05);实验组穿膜细胞数由对照的(115.5±13.1)个与(123.3±14.9)个上升至(224.3±24.6)个(P0.05);与对照组细胞相比,AdBMP9组IL-6的表达上调,磷酸化Akt蛋白表达上调。该研究表明,BMP9可能通过上调IL-6的表达,激活PI3K/Akt信号通路,促进人肺腺癌A549的侵袭、迁移。     

人IL-6受体胞外区真核表达载体的构建及体外表达

目的构建人IL-6受体（IL-6R）胞外区真核表达载体,检测其在体外培养细胞中的表达。方法利用PCR扩增IL-6R胞外区,克隆到pcDNA3．1（＋）中,用双酶切、测序鉴定。重组质粒通过脂质体转染HL-60细胞,用G418进行筛选,利用Western印迹检测IL-6R蛋白表达。结果PCR扩增出1218bp的目的片段,双酶切和测序结果显示重组质粒正确。Western印迹结果显示转染细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建了人IL-6R胞外区真核表达载体,并且能够在真核细胞中表达。     

细菌脂多糖诱导人单核细胞株对细菌脂蛋白的耐受性及其与肌动蛋白骨架关系

细菌脂多糖(LPS)可诱导宿主对LPS的耐受,但对细菌脂蛋白(BLP)是否存在交叉耐受,目前报道不一。采用人单核细胞株(THP-1),建立小剂量LPS诱导THP-1对LPS耐受的细胞模型;观察细胞肌动蛋白骨架、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度及NF-κB的DNA结合活力的变化情况;探讨BLP交叉耐受及细胞骨架在其中的作用。结果显示,THP-1细胞经小剂量(10ng/ml)LPS、大剂量(100ng/ml)LPS或BLP刺激后,细胞形态严重变形,肌动蛋白重组,细胞周边肌动蛋白丝带消失,出现明显的肌动蛋白收缩团块及伪足,细胞核内NF-κB的DNA结合活性显著升高,培养上清液中炎症因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)的释放显著增加;而小剂量LPS预刺激12h后,再用大剂量的LPS或BLP刺激6h,上述指标明显改善;采用细胞骨架肌动蛋白聚集破坏剂鬼笔环肽预处理后的THP-1细胞,可取消由小剂量LPS诱导的自身耐受及对BLP的交叉耐受;可见,细菌LPS、BLP(100ng/ml)可诱导THP-1细胞肌动蛋白骨架的改变,激活NF-κB信号通路,诱导炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6过度释放,激活宿主炎症细胞的炎症反应;而小剂量LPS预刺激后可诱导出THP-1细胞对LPS的自身耐受和对BLP的交叉耐受;细胞骨架肌动蛋白参与了小剂量LPS诱导THP-1细胞对LPS自身耐受和对BLP交叉耐受的形成。     

IL-6在胶质母细胞瘤的表达及作用机制研究

目的:探讨白介素6(IL-6)在胶质母细胞瘤(GBM)中的表达,并探讨其高表达的作用机制,以期阐明GBM发生发展潜在分子机制。方法:采用免疫组化检测表皮生长因子变体3 (EGFRv III)阳性和阴性GBM组织IL-6的相对表达。以恶性胶质瘤细胞U87MG为研究对象,构建表达EGFRv III的U87MG-EGFRvIII细胞,用IL-1β分别处理U87MG、U87MG-EGFRvIII细胞,ELISA检测IL-6分泌量。采用EGFR下游效应通路p38MAPK、MK2、MEK1/2、JNK抑制剂SB、sc-48、PD、SP预处理细胞1小时,IL-1β刺激细胞后,检测各组IL-6分泌量变化。将IL-1β处理后的U87MG-EGFRvIII细胞记为IL-1β组,以不做任何处理细胞记为Control组,用联合SB、sc-48处理的IL-1β细胞依次命名为IL-1β+SB和IL-1β+sc-48组,western blot检测p38MAPK-MK2通路蛋白和IL-6蛋白表达,qPCR检测IL-6 m RNA表达。结果:IL-6在EGFRv III阳性GBM组织中普遍高表达,在EGFRv III阴性GBM组织中普遍低表达。EGFRv III可在未受IL-1β刺激的恶性胶质瘤细胞中上调IL-6基础分泌,也可在IL-1β刺激情况下进一步促进IL-6分泌。在U87MG细胞中,所有通路抑制剂对IL-6分泌均无影响;在U87MG-EGFRvIII细胞中p38 MAPK-MK2通路抑制剂SB和sc-48明显抑制IL-1β诱导的IL-6分泌,而MEK1/2、JNK抑制剂PD和SP则无明显影响。IL-1β能够诱导p38MAPK-MK2通路激活,诱导细胞内IL-6表达增加,联合SB、sc-48处理细胞后,p38MAPK-MK2通路活性降低,细胞内IL-6表达降低。结论:癌基因EGFRv III能够上调恶性胶质瘤细胞中IL-6基础分泌,IL-1β可进一步刺激IL-6分泌,其机制可能与p38MAPK-MK2通路激活有关。     

白细胞介素13通过STAT6途径促进瘢痕成纤维细胞株胶原合成

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维化过程,是创伤修复的必然产物。白细胞介素13(IL-13)是与纤维化等多种疾病发生机制密切相关的细胞因子。本文观察重组白细胞介素13(rIL-13)对瘢痕成纤维细胞株(CRL-1762)的胶原合成作用,探讨其作用机制。CRL-1762细胞分为实验组和对照组,实验组加入rIL-13(100μg/L),用细胞计数和HE染色观察细胞增殖和细胞形态;检测细胞培养上清液中羟脯氨酸(Hyp)含量;RT-PCR检测细胞IL-13受体的表达;用Western blot检测STAT6蛋白磷酸化情况。结果显示CRL-1762细胞表达IL-13受体α1;实验组细胞数量显著增加(P0.01),上清液中Hyp含量显著高于对照组(P0.01);IL-13作用CRL-1762细胞2 h后磷酸化STAT6蛋白表达最强,4h后衰减。由此可见,CRL-1762细胞表达IL-13受体α1,rIL-13通过STAT6途径促进CRL-1762细胞胶原合成。     

猪白细胞介素17A基因的克隆与鉴定

猪白细胞介素17A(IL-17A)是猪白介素17家族的重要成员,在猪体内发挥重要作用的细胞因子。本研究将猪的外周血单核细胞分离后,用Con A刺激22 h后提取细胞的总RNA,RT-PCR方法扩增出猪IL-17A基因,将其PCR产物回收纯化克隆至p MD-18T载体上,转化至大肠杆菌DH5α,PCR和双酶切鉴定筛选阳性重组克隆质粒。结果显示,筛选的重组克隆质粒为阳性克隆质粒,基因片段为目的基因。克隆获得的猪IL-17A基因的序列与Gen Bank上公布的猪IL-17A基因序列同源性高,为99.4%。本研究成功克隆了IL-17A基因,有助于研究其在猪病毒性疾病中的作用。     

人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建人白细胞介素6(IL-6)的原核表达载体并优化其表达条件,为IL-6的高效表达提供试验依据。以人T细胞cDNA为模板通过PCR方法扩增IL-6基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用Western blotting及人IL-6检测试剂盒分析鉴定。在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化IL-6表达条件。结果显示,原核表达载体pET28 a(+)-IL-6成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约22 kD的IL-6蛋白,经Western blotting鉴定正确,经人IL-6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。在IPTG浓度400μmol/mL,卡那霉素浓度50μg/mL,40℃培养6 h的条件下,目的蛋白表达量最高,可占总蛋白表达量的40%。成功构建人IL-6原核表达载体且获高效表达,为研究IL-6生物学活性及产品开发提供了试验基础。