重组金黄色葡萄球菌次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶与脂蛋白(a)的相互作用

次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,它可以通过赖氨酸结合位点(LBS)与Plg相结合。脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apo(a)]与Plg有很高的同源性,即两者的Kringle结构域都含有LBS,其中Apo(a)的KIV10含有强的LBS。因此本实验提出了Lp(a)应该能够与S.aureus表面的Plg受体相结合,进而可能竞争性抑制S.aureus与Plg结合的假说。本研究克隆了S.aureus的IMPDH基因,酶切后将其连接到表达载体pASK-IBA37中,并在大肠杆菌BL21中表达了该重组蛋白(rIMPDH)。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、亲和色谱层析及Western blot对rIMPDH与Lp(a)的相互作用机制进行了研究。结果表明rIMPDH可以通过LBS与Lp(a)和rKIV10发生特异性结合,而且一定浓度的赖氨酸类似物6-氨基己酸(EACA)可以抑制这种结合,然而本研究并未发现Lp(a)和rKIV10对rIMPDH与Plg的相互作用有明显的抑制。     

重组不可分型流感嗜血杆菌E蛋白与血浆脂蛋白(a)的相互作用

目的:E蛋白(Protein E,PE)是不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenza,NTHi)表面的一种纤溶酶原(plasminogen,Plg)受体,其C末端含有两个赖氨酸残基。NTHi可通过其表面的PE与Plg结合,从而利用机体的纤溶系统深层入侵宿主。基于脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]中载脂蛋白(a)[Apolipoprotein(a),Apo(a)]与Plg高度的同源性,拟证明Lp(a)是否会与重组表达的PE(r PE)结合。方法:原核表达并纯化r PE及敲除C末端两个赖氨酸残基的r PEΔKK,密度梯度离心结合阴离子交换层析分离人血浆Lp(a),通过ELISA、Pull down、Western blot等方法研究r PE与Lp(a)的相互作用。结果:r PE与Lp(a)结合,但不与LDL结合,且r PEΔKK与Lp(a)的结合能力明显低于r PE;赖氨酸类似物6-氨基乙酸(EACA)能有效抑制r PE与Lp(a)的结合;Lp(a)对r PE与Plg的结合具有微弱的抑制作用。结论:r PE能够与Lp(a)结合,其中r PE的C末端赖氨酸残基和Apo(a)的赖氨酸结合位点(lysine binding sites,LBS)是r PE与Lp(a)结合的主要位点。     

M41型A群链球菌的Ⅰ型胶原样蛋白与人低密度脂蛋白的相互作用

【目的】检测M41型A群链球菌(GAS)ATCC12373中Ⅰ型胶原样蛋白(Scl1)与人低密度脂蛋白(LDL)的相互作用。【方法】克隆了M41型GAS ATCC12373的Ⅰ型胶原样蛋白(Scl1)及其V区(Scl1-V)基因,并表达、纯化重组蛋白rScl1(C176)和rScl1-V(C176V)。通过重组蛋白与人血浆的亲和色谱层析、Western blot及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测C176、C176V与LDL的相互作用;通过GAS与LDL的ELISA试验和人血浆与GAS的共孵育试验,检测GAS与LDL的相互作用。【结果】结果证明C176和C176V可以与LDL特异性结合;表达Scl1的M41型GAS可以与LDL相结合。【结论】M41型GAS的Scl1可以与LDL特异性结合。     

铜绿假单胞菌表面(氧化)低密度脂蛋白配体的研究

【背景】研究发现铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与(氧化)低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL/oxidized low density lipoprotein,ox LDL)具有特异性相互作用,有报道证实P. aeruginosa表达的Rah U蛋白可以与LDL/ox LDL特异性结合。【目的】验证Rah U蛋白是否是P.aeruginosa表面主要的LDL/ox LDL配体。【方法】大肠杆菌表达Rah U蛋白(r Rah U),ELISA验证r Rah U与LDL/ox LDL的相互作用。利用同源重组的方法构建RahU基因缺失突变株(ΔRahU菌株)作为阴性对照菌株,制备小鼠抗r Rah U抗体,经WesternBlot及ELISA分别检测抗r Rah U抗体与P.aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白的结合。通过ELISA方法对P. aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/ox LDL的结合差异进行比较,并对不同蛋白酶水解ΔRahU菌体表面蛋白后ΔRahU菌株与LDL/ox LDL结合能力的差异进行比较。【结果】经ELISA验证rRahU与LDL/oxLDL存在特异性结合。Western Blot及ELISA方法证实小鼠抗rRahU抗体可以与P. aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白特异性结合,而不与ΔRahU菌株相互作用。P.aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/oxLDL结合能力无显著差异,且蛋白酶水解后ΔRahU菌株与LDL/oxLDL的结合能力相近。【结论】RahU蛋白是P. aeruginosa表面的LDL/oxLDL配体之一,但不是唯一的配体。     

FtsZ(236-245)区域的两性螺旋特性对大肠埃希氏菌FtsZ组装和功能的影响

【目的】探索大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)FtsZ(236-245)结构域两性螺旋特性对FtsZ组装和FtsZ-FtsA相互作用的影响。【方法】利用分子克隆和定点突变技术,构建FtsZ及其突变体表达载体,亲和纯化获得相应目标蛋白;通过同源重组和Pl转导构建QN23-QN29菌株;利用活细胞成像观察FtsZ及其突变体的胞内定位特点;膜蛋白分离和Western blot分析FtsZ突变体的膜结合特性变化;非变性胶分离和体外聚合分析检测定点突变对FtsZ单体组装特性的影响;免疫沉淀和Far Western blot实验检测FtsZ/FtsZ~*-FtsA间的相互作用。【结果】FtsZ~(E234A/K)和FtsZ~(E241A/K)突变体的功能活性降低、备突变体在E.coli内不能正确定位和形成功能性Z环;E237A/K和E241A/K位点突变致备突变体聚合能力降低、FtsZ*-FtsA的相互作用减弱和FtsZ的膜结合特性变化。【结论】E237和E241是影响FtsZ(236-245)区域两性螺旋特性和FtsZ组装及FtsZ-FtsA相互作用的重要氨基酸。     

脂蛋白(a)的赖氨酸结合异质性对人动脉SMC增殖的影响

为探讨脂蛋白 ( a) [Lp( a) ]的赖氨酸结合功能在致动脉粥样硬化中的作用 ,利用短时超速离心结合凝胶层析分离纯化 Lp( a) ,以 Lysine- Sepharose4B亲和层析分离出能与柱结合的 Lp( a)Lys+ 和不能与柱结合的 Lp( a) Lys-.采用 MTT比色法、流式细胞仪分析细胞增殖状况 ,同时以ELISA法检测细胞培养液中转化生长因子β( TGF-β)的活化水平 ,观察了两种 Lp( a)对培养的人动脉平滑肌细胞 ( SMC)增殖的影响 .结果表明 :Lp( a)、Lp( a) Lys+ 较 Lp( a) Lys-能有效地促进SMC增殖 ,刺激细胞从 G0 /G1期进入 S和 G2 /M期 ,并显著降低培养液中 TGF- β活化量 .提示 :Lp( a) Lys+ 可能是 Lp( a)促人 SMC增殖的主要组分 ,其机制可能与干扰纤溶酶原活化 ,从而抑制TGF-β活化有关 .     

地中海富盐菌PhaE蛋白乙酰化修饰对其功能的影响

【目的】研究地中海富盐菌PHA合酶(Pha EC)中Pha E亚基乙酰化修饰对其功能的影响,探讨乙酰化修饰对菌体生理代谢的调控作用。【方法】蔗糖密度梯度离心收集PHA颗粒,质谱鉴定颗粒结合蛋白Pha E的乙酰化位点。将乙酰化位点(赖氨酸,K)分别突变为精氨酸(R)(模拟去乙酰化)或谷氨酰胺(Q)(模拟乙酰化),利用同源双交换原理,将突变后的基因原位敲入基因组。以野生型为对照,检测突变对菌体生长、葡萄糖消耗和PHA合成能力的影响。利用Western blot检测PHA颗粒上Pha E的含量,进一步分析乙酰化修饰对蛋白功能的影响。【结果】在Pha E蛋白105位和170位赖氨酸(K)2个位点检测到乙酰化修饰。利用遗传操作系统将突变的基因原位敲入,共得到6种突变株。发酵结果表明,任何一种单突变对菌体生长及PHA合成的影响均不明显。但当2个位点同时突变成精氨酸(K105R/K170R)时,突变株生长及合成PHA的能力均受到明显抑制,2个位点同时突变成谷氨酰胺(K105Q/K170Q)则无明显影响。进一步的Western blot结果表明,突变成精氨酸的双突变株的PHA颗粒上,Pha E蛋白的含量相较于野生型约降低了一半。【结论】Pha E蛋白的去乙酰化能够导致菌株利用葡萄糖合成PHA的能力显著降低,其可能原因是降低了Pha E与PHA颗粒或PHA颗粒上Pha C的结合能力,从而降低了Pha EC合酶的活性。     

抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及鉴定

【目的】提高抗对硫磷抗体的亲和力以提高酶联免疫检测的灵敏度。【方法】本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得了抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因(scfv-sa),并将该融合基因(scfv-sa)插入到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,制备融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定scfv-sa的表达,Ni+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,并用ELISA方法测定该融合抗体的亲和力。【结果】结果表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中该融合基因能表达出分子量约为46kDa的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107L/mol。【结论】制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。     

转录调节因子σ~(38)介导铜绿假单胞菌绿脓菌素合成代谢调控

【目的】为了进一步鉴定铜绿假单胞菌转录调控因子σ~(38)对2个拷贝吩嗪合成基因簇(phz A1-G1和phz A2-G2)的具体调控方式并推定介导绿脓菌素合成代谢的可能调控机制。【方法】根据铜绿假单胞菌基因组信息,利用同源重组原理构建rpo S基因缺失突变株Δrpo S以及克隆全长rpo S基因作互补分析;再以单一吩嗪基因簇缺失突变株Δphz1和Δphz2为出发菌株,分别构建rpo S缺失突变株Δrpo Sphz1和rpo S插入突变株Δrpo Sphz2,测定并比较野生株及相关突变株的绿脓菌素合成量,初步推定σ~(38)因子对2个不同吩嗪基因簇表达的调控方式。【结果】在GA培养基中,突变株Δrpo S的绿脓菌素合成量比野生株显著增加;互补分析证实,σ~(38)可使突变株Δrpo S的绿脓菌素降低并接近野生株PAO1水平;与对照株Δphz1相比,突变株Δrpo Sphz1的绿脓菌素合成量因σ~(38)因子缺失而显著减少;而与对照株Δphz2相比,突变株Δrpo Sphz2的绿脓菌素合成量因σ~(38)因子缺失显著增加。【结论】转录调控因子σ~(38)对铜绿假单胞菌绿脓菌素的合成代谢的确具一定的负调控作用;结合已报道的研究结果,初步推定:σ~(38)因子通过负调控吩嗪基因簇phz1,正调控吩嗪基因簇phz2的表达实现对绿脓菌素合成代谢的调控。     

Marinacarbolines甲基化基因mcbD的筛选及其功能

【目的】定位Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652基因组中负责marinacarbolines甲基化修饰的基因mcbD并鉴定其功能。【方法】游离M.thermotolerans SCSIO 00652的基因组序列中功能注释为甲基转移酶的蛋白,使用MEGA 6自带的ClustalW与来自于marformycins生物合成途径中的Mfn G(D/L-酪氨酸甲基化酶)进行多序列比对,用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树,筛选到与MfnG进化关系最近的Orf03255(Mcb D);扩增mcbD后克隆至pET28a(+)并在E.coli BL21(DE3)中表达,结合Ni-NTA亲和层析法纯化获取较高纯度的McbD活性蛋白;以marinacarboline B为底物,利用高效液相色谱检测McbD的体外酶活;利用基于PCR-targeting的遗传操作体系构建mcb D插入失活突变株((35)mcbD)并分析其与野生型菌株的发酵产物差异。【结果】N-末端融合组氨酸标签的McbD蛋白在E.coli BL21(DE3)中可溶性表达,亲和层析纯化的McbD能够以marinacarboline B为底物催化形成marinacarboline C;mcbD基因阻断突变株ΔmcbD与野生型相比不产生化合物marinacarboline C,同时累积marinacarboline B。【结论】McbD为marinacarbolines生物合成中必需的O-甲基转移酶。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.