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生殖系嵌合体的获得是实现ES细胞介导的转基因途径的决定步骤,而嵌合体的制作及生殖系嵌合体的获得则是判定ES细胞系是否具有配子分化能力的有效方法。利用一株表达绿色荧光蛋白的杂种ES细胞系制备出嵌合体小鼠,共获得9只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠,其中有8只雄性,1只雌性,目前均发育成健康成年小鼠。流式细胞检测显示了绿色荧光蛋白在嵌合鼠以下器官的表达情况:心(77.96±15.78)%、脾(84.06±3.60)%、肾(42.49±19.79)%、骨髓(52.02±18.78)%。昆明雌鼠与雄性嵌合鼠杂交1代(F1)毛色表型分析显示该株ES细胞具有生殖系嵌合能力。 相似文献
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小鼠ES细胞种系嵌合体的获得 总被引:14,自引:0,他引:14
种系嵌合体的获得是实现ES细胞介导的转基因途径的决定步骤,ES细胞种系分化能力的保持是决定种系嵌合的前提条件,而事体的主种系嵌合体的获得则是判定ES细胞系是否具有种系分化能力的唯一方法,为考察本室新近建立的3种小鼠ES细胞系MESPU21.MESPU22和MESPU29的种系分化能力,选用近交系C57BL/6J及远交系KMW和ICR为受体胚胎提供者,分别通过囊胚注射法和8细胞期桑椹胚注射法进行了嵌 相似文献
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绿色荧光蛋白嵌合体小鼠的建立和鉴定 总被引:7,自引:0,他引:7
为研究嵌合体动物中供体胚胎干细胞 (ES)在宿主胚胎发育中的走向和定位 ,同时探讨绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值 ,本研究将pEGFP N1基因导入小鼠ES D3 细胞系 ,得到稳定表达GFP的胚胎干细胞亚系ES D3 GFP ,通过对昆明小鼠的囊胚腔注射 ,获得了 4只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠。其中 1只存活至成年 ,3只出生时死亡。荧光显像及组织PCR检测显示了绿色荧光蛋白在小鼠体内的嵌合情况。以绿色荧光为指标可实现活体水平的动态观察 ,本实验首次观察到以GFP为指标所示的机体嵌合情况与根据毛色嵌合推测的机体嵌合情况存在很大差异 ,以GFP为嵌合指标更加全面而准确 ;但不排除GFP对小鼠发育存在一定毒性的可能 ;另外 ,有结果显示供体ES细胞在宿主体内除了大片补丁状嵌合外 ,还存在细胞散在嵌合的情况 ,后者提示了在组织中利用GFP对ES细胞实施单细胞追踪和实时观察的可行性 ,为胚胎发育和疾病发生的相关研究提供了新的观察方法 相似文献
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远交系小鼠胚胎干细胞系的建立及嵌合鼠的获得 总被引:2,自引:0,他引:2
ES细胞(Embryonic Stcm Cells)是来源小鼠早期胚胎的多潜能干细胞,它可以在体外大量培养,并以单细胞的形式注射到早期胚胎里,发育为嵌合体,到目前为止,通常使用的129小鼠品系是来源于近交系(inbrcd)小鼠的胚胎。与之相比,远交系小鼠应当具有较强的生命力和抗病能力。曾有人报道过建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,但是尚没有见到获得嵌合鼠的报道。有人甚至认为:由于不同品系小鼠所具有的遗传背景不同,有的小鼠不能建成ES细胞系。最近,本实验室在这方面做了有益的探索,成功地建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,并在这里报导首例用远交小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。采用源于Swiss小鼠远交群的昆明(KM)品系小鼠囊胚建成了三个小鼠胚胎干细胞系(KE1,KE2,KE5)。核型正常率均达到70%以上。自第八代起分批存。复苏后,培养至第12代,消化成单细胞,通过囊胚显微注射,将其注射到615品系小鼠胚胎。在幸存的幼鼠中获得了一只来源于KE1细胞的嵌合鼠(Table1)。其毛色表现为受体鼠(615)的白色中嵌合有供体鼠(KM)黑褐色(Platc I-A)。嵌合鼠与受体鼠的杂交后代鼠中仍然出现了受体鼠的毛色类型(PlateI-B)。证明:ES细胞能嵌合到生殖腺并形成具有正常功能的配子,从而产生种系嵌合鼠。 相似文献
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为探讨印迹基因H19的甲基化状态与ES小鼠胚胎发育之间的关系, 以遗传背景相同的正常成年对照小鼠、22只成年ES小鼠和8只新生死亡的ES小鼠以及不同传代次数的ES细胞为实验材料, 利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR技术分别检测了其印迹基因H19的5′非翻译区两个位点的甲基化状态。结果表明, 发育至成年的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与正常成年对照小鼠之间没有差异, 而新生死亡的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠相比则存在明显差异。推测ES细胞中印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠之间可能存在 差异。 相似文献
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C57BL/6J小鼠ES细胞系的建立及其特性分析 总被引:11,自引:1,他引:11
本文报道从C57BL/6J个鼠的囊胚中,建立了三个ES细胞系MESPU17,MESPU18,MESPU19。这些细胞的细胞学特征和强AKP反应,表明这三个细胞系具有干细胞的特征。这三个细胞系均为XY型,正常二倍体核型分别占70%、88%和59%。体外分化可形成简单类胚,体内分化可形成瘤块。与国际上通用的CCE和来自129/ter的ES细胞MESPU13相比,这三个细胞系的ES细胞较大;在体外培养时,生长较慢;细胞也较粘,进行显微注射时,很容易粘在注射针壁上。MESPU17,MESPU18进行了嵌合体制作,以BALB/c和昆明鼠的囊胚为受体,采用囊胚注射法未获嵌合体,但使用昆阴鼠的8细胞胚注射法和共培养法得到嵌合体。 相似文献
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目的 研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法 以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果 饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ;有饲养层的培养条件下 ,桑椹胚的ES细胞集落出现率显著低于囊胚 ;两种饲养层培养囊胚 ,其ES细胞集落的出现率差异无显著性。结论 以PMEF或NIH3T3细胞作饲养层 ,培养昆明小鼠的囊胚 ,适时离散ICM ,是比较理想的分离ES细胞集落的方法。 相似文献
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ES细胞(MESPU13)嵌合体小鼠的GPI分析 总被引:8,自引:0,他引:8
为了评判小鼠ES细胞系MESPU13的分化潜能,我们对19只嵌合小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胰腺、生殖腺、肌肉和血液的GPI(磷酸葡萄糖异构酶)进行了分析。在这些样品中,来源于ES细胞的A型条带的检出情况和小鼠的毛色嵌合率成正比关系。当毛色嵌合率低于40%时,除了少数小鼠的肾脏外,没有看到A型的条带。当毛色嵌合率大于85%时,几乎所有的器官组织都检测到A型条带,显示了ES细胞在发育形成内、中、外胚层的细胞方面具有很高的分化潜能。另外,在毛色嵌合率大于85%的其中的6只嵌合鼠的肌肉中,只观察到A型的条带,表明这些肌肉只单独来源于ES细胞。 相似文献
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远交系小鼠胚胎干细胞系的建立及嵌合鼠的获得 总被引:2,自引:0,他引:2
ES细胞(EmbryonicStemCells)是来源于小鼠早期胚胎的多潜能干细胞,它可以在体外大量培养。并以单细胞的形式注射到早期胚胎里,发育为嵌合体。到目前为止,通常使用的129小鼠品系是来源于近交系(inbred)小鼠的胚胎.与之相比,远交系小鼠应当具有较强的生命力和抗病能力。曾有人报道过建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,但是尚没有见到获得嵌合鼠的报道。有人甚至认为:由于不同品系小鼠所具有的遗传背景不同,有的小鼠不能建成ES细胞系。最近,本实验室在这方面做了有益的探索,成功地建成了远交系小鼠胚胎干细胞系,并在这里报导首例用远交系小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。采用源于Swiss小鼠远交群的昆明(KM)品系小鼠囊胚建成了三个小鼠胚胎干细胞系(KE1.KE2.KE5)。核型正常率均达到70%以上。自第八代起分批冻存,复苏后,培养至第12代,消化成单细胞,通过囊胚显微注射,将其注射到615品系小鼠胚胎。在幸存的幼鼠中获得了一只来源于KE1细胞的嵌合鼠(Table1).其毛色表现为受体鼠(615)的白色中嵌合有供体鼠(KM)的黑褐色(PlateI-A).嵌合鼠与受体鼠的杂交后代鼠中仍然出现了受体鼠的毛色类型( 相似文献
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从129S1小鼠早期胚胎的内细胞团分离、培养类胚胎样细胞,经反复传代,成功地建立了129S1小鼠胚胎干细胞系,命名为NM-2细胞系。形态学鉴定具有胚胎干细胞的典型形态特征,正常核型率为80%;呈碱性磷酸酶阳性、表达胚胎干细胞特异性转录因子OCT-4;体内分化后可形成源于三胚层的组织结构;经囊胚腔显微注射后所获得的子代个体中79%具有毛色嵌合表型;雄性嵌合个体中31%发生生殖腺嵌合;同时,通过育种观察到所有生殖腺嵌合体的子代小鼠表型正常。以上结果证实NM-2细胞系为一株具高生殖腺嵌合能力的小鼠胚胎干细胞系。 相似文献
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Qing Wang Xiuli Gong Zhijuan Gong Xiaoyie Ren Zhaorui Ren Shuzhen Huan Yitao Zeng 《遗传学报》2013,40(12):617-628
Hemophilia A (HA) is an inherited X-linked recessive bleeding disorder caused by coagulant factor VIII (FVIII) deficiency. Previous studies showed that introduction of mesenchymal stem cells (MSCs) modified by FVIll-expressing retrovims may result in phenotypic correction of HA animals. This study aimed at the investigation of an alternative gene therapy strategy that may lead to sustained FVIII transgene expression in HA mice. B-domain-de/eted human FVIll (hFVHIBD) vector was microinjected into single-cell embryos of wild-type mice to generate a transgenic mouse line, from which hFVIIIBD-MSCs were isolated, followed by transplantation into HA mice. RT-PCR and real-time PCR analysis demonstrated the expression of hFVlllBD in multi-organs of recipient HA mice. Immunohistochemistry showed the presence of hFVIIIBD positive staining in multi-organs of recipient HA mice. ELISA indicated that plasma hFVIIIBD level in recipient mice reached its peak (77 ng/ mL) at the 3rd week after implantation, and achieved sustained expression during the 5-week observation period. Plasma FVIII activities of recipient HA mice increased from 0% to 32% after hFVIIIBD-MSCs transplantation. APTT (activated partial thromboplastin time) value decreased in hFVIIIBD-MSCs transplanted HA mice compared with untreated HA mice (45.5 s vs. 91.3 s). Our study demonstrated an effective phenotypic correction in HA mice using genetically modified MSCs from hFVIIIBD transgenic mice. 相似文献
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5个品系小鼠胚胎干细胞系建立的方法学比较 总被引:11,自引:0,他引:11
以70%的大鼠心脏细胞条件培养基(RH-CM)为培养液,以小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)为饲养层,采用添加1%鸡血清的消化液和“连续离散法”作为小鼠Es细胞建系的改进方法,比较了5个品系小鼠ES细胞系建立的特点。与常规方法相比,3个近交系小鼠129/ter、C57BL/6J、BALB/c的ES细胞建系率分别由11.8%、3.7%和2.9%提高到33.3%、13.3%和19.4%,差异十分显著;直接采用改进的方法建立KM和ICR小鼠ES细胞系,建系率分别达12%和42.1%。讨论了ICM增殖的时间,即离散时机对ES集落形成及建系率的影响,结果显示:129/ter、C57BL/6J、BALB/c、KM和ICR小鼠品系ICM适宜的离散时机分别为增殖4~6d、3~3.5d、4d、4~5d和4~5d;同时,讨论了不同ES细胞建系所需最适宜的消化液浓度,其中BALB/c小鼠的ES细胞对高浓度的消化液十分敏感,0.05%Trypsin-0.008%EDTA是其比较理想的离散浓度。设计了两种离散方法,即“一次离散法”和“连续离散法”,用来离散增殖的ICM和ICM离散后出现的ES集落,结果表明:后者在建系过程中的作用明显优于前者。RH-CM与添加uF的常规ES细胞培养基相比,不但具有显著抑制小鼠ES细胞分化、维持其二倍体核型的作用,而且明显促进ES细胞的贴壁生长。新建细胞系鉴定结果表明,这一改进方法有效地维持了其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征。 相似文献
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常规基因剔除小鼠的获得主要是利用ES细胞的全能性先获得嵌合体小鼠,再利用:ES细胞的生殖系传递能力,通过嵌合体与野生型小鼠的交配获得杂合子小鼠.而四倍体补偿技术则可绕过嵌合体小鼠阶段,直接获得基因修饰杂合子小鼠.利用电融合技术和Piezoelectric microinjecfion显微注射技术建立了四倍体补偿技术,小鼠四倍体胚胎的获得率(电融合率)为(93.01±l.37)%,经体外培养囊胚形成率为(82.49±2.08)%.通过显微注射方法将2种129品系小鼠来源的ES细胞(CJ7和SCR012)注射到四倍体囊胚腔中,获得了完全ES细胞来源的小鼠,ES鼠的获得率分别为2.7%和8.3%.经微卫星DNA检测,成体小鼠的10个被检测组织均为129小鼠来源的.同时,也利用基因修饰的ES细胞进行了研究,获得了2种基因修饰的完全ES细胞来源的杂合子小鼠,部分小鼠具有繁殖能力,经繁育已获得了纯合子,其中凝血因子Ⅷ基因敲除小鼠获得了预期的血友病小鼠表型.上述结果说明四倍体补偿技术可应用于基因修饰小鼠的制备. 相似文献