酶学方法第118卷《植物分子生物学》

此书分九个部分:1.细胞壁和膜;2.细胞核;3.细胞质的蛋白质合成;4.叶绿体;5.线粒体;6.氮代谢;7.细胞培养与转化;8.基因转移;9.病毒学。 该书专门介绍植物分子生物学有关问题。代方法,并附有参     

黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质

漆酶是一种应用广泛的绿色环保的多酚氧化酶。漆酶过去被认为广泛存在于植物、昆虫和真菌中,而近年来,越来越多的细菌中也发现了漆酶的存在。黏细菌是一类重要的资源菌,但与一般细菌相比,较难分离和纯化。文中利用生物信息学的方法,综合应用Blast和隐马尔可夫模型方法对黏细菌蛋白质组数据库进行搜索,并根据多铜氧化酶的保守铜离子结合位点进行进一步筛选,获得30个候选黏细菌漆酶序列。挑选其中9个,在大肠杆菌中进行重组表达。利用2,6-甲氧基苯酚(DMP)等常用漆酶底物检测重组酶的催化氧化活性,其中7个重组蛋白具有漆酶催化活性。选择1个对2,6-甲氧基苯酚(DMP)具有较高氧化活性的重组酶(命名为rSC-2),通过Ni-NTA亲和层析柱纯化rSC-2,测试其酶学性质。纯化的rSC-2蛋白分子量约57 kDa,在最适反应条件下,rSC-2催化DMP反应的比酶活为0.27 U/mg。催化DMP反应的最适温度为60℃,最适pH为7.0。rSC-2在pH 7.0-8.0有较高酶活,在60℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低浓度的Ca~(2+)对酶活有一定的促进作用,而较高浓度的Fe~(3+)、Co~(2+)、Ba~(2+)对酶活的抑制作用较明显。这是首次对黏细菌漆酶序列进行系统性的生物信息学分析,并实现纤维堆囊菌Sorangium cellulosum序列来源的漆酶活性蛋白在大肠杆菌细胞中重组表达。     

组换元DNA实验技术(即:重组DNA实验技术)(日文本)

本书由日本遗传工程界的60多位科学家,从各自擅长的方面撰写而成。     

基因操作原理(续完)——第十章 重组DNA研究的有关问题

迄今,以重组DNA研究获得最大好处的无疑是分子生物学本身了。联合应用Southern墨迹转移杂交技术和核苷酸序列快速分析法,重组DNA技术有可能对大量的真核基因结构进行详细的分析。仔细阅读本书的读者有可能了解到基因结构知识的现代进展,并将认识到这种知识的重要性。     

第十届全国酶学学术讨论会(第一轮通知)

由中国生物化学与分子生物学会酶学专业委员会、浙江清华长三角研究院、上海交通大学生命科学技术学院共同主办的第十届全国酶学学术讨论会定于2011年10月21-24日在杭州举行。本次学术会议将邀请在国内外     

重组E．coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组E.coli产生的胆固醇氧化酶采用70%硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子层析、Phenyl Sepharose 6 Fast疏水层析、Sephadex G-75凝胶过滤,得到的胆固醇氧化酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带,酶的纯化倍数为93,收率为21%.部分酶学性质表明:酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH7.5,热稳定范围在40℃以下,酶的pH稳定范围为6～9,分子量分别为50 kD和52 kD.酶动力学参数Km值及Vmax分别为8.2×10-5 mol/L和0.21 mmol/(L.min).     

重组菌产碱性果胶酯裂解酶酶学性质研究

利用盐析-透析-色谱流程建立快速高效纯化工程菌E.coli JM109(pHsh PL)所产碱性果胶酯裂解酶(PL)的方法,纯化后酶达到电泳纯,比酶活为1079U/mg.重组菌所产PL酶促反应适宜的pH为9～10,适宜温度为50～66 ℃,与酶基因来源野生菌所产PL相比,重组菌所产PL适宜pH范围有所扩大,并保持了野生菌PL的热稳定性.通过金属离子种类、浓度及存在时间对PL酶活力影响考察发现:在考察的离子中除Mg2 对酶活有较好的促进作用外,其余对重组菌PL均有抑制作用,其中Fe2 对酶活力抑制作用最强.该酶的Km值为20.93 mg/L,Vmax为105.3 μmol/min,反应活化能Ea为21.74 kJ/mol.对重组菌所产PL热稳定动力学进行分析,发现有底物情况下的失活常数kd(0.02 min-1)小于无底物情况下的失活常数kd(0.0342 min-1),说明当酶与底物结合形成复合物时对酶活具有保护作用.利用HPLC-ESI-MS对重组菌所产PL酶解产物进行测定发现,产物含有不饱和二聚半乳糖醛酸(m/z 350.82)和不饱和三聚半乳糖醛酸(m/z 527.04),同时测定结果中没有发现不饱和半乳糖醛酸单体(m/z 175),可以初步推测重组菌PL不能以不饱和二聚半乳糖醛酸和不饱和三聚半乳糖醛酸为底物进一步裂解.     

用于(医学)诊断的DNA探针

用DNA作诊断试验是非常迅速、灵敏和特异的,容易进行并容易分析。DNA杂交试验的非放射性检测方法出现,对现代的重组DNA技术从研究实验室进入更接近临床的实验室起到了相应大的促进作用。在这里要谈到这项新颖技术的基本原则及其应用。 DNA探针是一种能够识别并能特异地与互补DNA片段,即使这些互补的DNA序列是在其它完全无关的DNA序列中。     

酶学方法《干扰素》

“酶学方法”是美国学院出版社(Academic Press)连续出版的一套丛书,每一卷一个专题,或一个专题分几卷连续出版。它是一套很好的参考书,也是科研的工具书。 干扰素是目前国际医药及遗传工程研究的重要对象之一。酶学方法的第78及79卷是专门介绍干扰素的两卷。     

浙江产蝮蛇Agkistrodon halys(Pallas)蛇毒磷酸二酯酶的酶学性质及其对大分子核酸的作用

1.以双对硝基苯磷酸钠为底物,测得蝮蛇毒磷酸二酯酶的最适pH在10左右,最适温度在60℃左右;酶在37℃和60℃的Km分别为5.65×10~(-4)M和7.97×10~(-4)M。 2.酶在pH5—10.5范围和50℃以下稳定。 3.钙离子和镁离子对酶活力有激活作用,但钡离子、镁离子、锌离子、二价铅离子、钴离子、二价和三价铁离子、锰离子、镍离子等都有不同程度地抑制作用。 4.除乙酸根离子外,碳酸根,硫酸根,乙二胺四乙酸根、磷酸根,钼酸根,酒石酸根,柠檬酸根,亚硝酸根,巴比妥酸根和硫代硫酸根等阴离子都有不同程度地抑制作用。 5.蝮蛇毒磷酸二酯酶能充分水解RNA和DNA但后者的水解速度比前者快许多。     

创新混合式教学在生物化学重组DNA技术(基因工程)教学中的应用

在教育信息化快速发展的形势下,如何合理地设计、组织并实施教学活动,进而实现学生的全面发展,是教师们努力探索的方向。《生物化学与分子生物学》(人民卫生出版社,第九版)的重组DNA技术一章具有较强的应用性,我们采用创新混合式教学模式,设计了线下课程导入,课前线上自主学习,课中将传统课堂、小组临床案例讨论及汇报与双师讨论课堂相结合,以及课后测验、实践和知识内化等教学活动。结果显示,生物化学理论知识与临床应用的融合巩固并拓展了学生对基础知识的理解,理论与实践相结合实现了生物化学学习的知行合一。这种教学模式符合人类认知基本规律,促进了学生的深度学习,不仅有助于培养学生的自主学习能力、表达和沟通能力、自我反思和评价能力,而且有效提升了学生的科研思维能力和医学知识水平,增进对患者的人文关怀,达到了较高层次的学习目标。该教学模式有助于从多方面培养临床医学创新人才,为新形势下生物化学课程教学改革提供借鉴。     

基因组基因定位(基因DNA酶解图谱技术)的计算机方法研究

本文提出基于酶解图谱技术的基因组基因定位的计算机方法,用于连接定位从克隆分析得到的数据．我们选择了若干例子作为研究对象,尝试了该方法的有效性．结果表明,计算机方法性能良好,可望成为大基因组基因定位的有用工具．     

NEB全球首推甲基化领域的颠覆性技术革新:一种高效替代重亚硫酸盐转化的酶学转化法!

虽然重亚硫酸盐测序是研究DNA甲基化的金标准,但这种转化方式会对DNA造成损伤,导致DNA断裂、丢失和GC偏嗜。NEBNext酶学转化法甲基化建库试剂盒(EM-seq■)提供了一种酶学方法代替全基因组重亚硫酸盐处理DNA(WGBS)的方法,并结合高效流程化的建库步骤,适用于Nlumina平台测序。     

用基因重组法生产红细胞生成素(EPO)

日本雪印乳业公司与京都大学农学部协作研究,发明了用基因重组技术生产EPO的有效方法。EPO是一种糖蛋白质增血激素,作为未来的增血剂而引人注目。     

国家卫生署(NIH)的人类DNA探针资源库和资料库:美国标准培养物保藏中心(ATCC)对人类遗传学的新作用

在人类遗传疾病诊断和人类基因图谱中的酶切片段长度多态性(RELP_s,restriction fragmentlength polymerphisas) 重组DNA技术为人类遗传学提供新的机会。应用直接基因探针、寡核苷酸探针以及酶切片段长度多态性(RELP_s),推进了遗传疾病的出生前诊断和人类基因组的图谱分析。     

快原子轰击质谱技术结合酶学方法鉴定黑曲霉1,6—缩水—β—D—吡喃葡萄糖激酶的诱导合成

1,6－缩水－β－D－吡喃葡萄糖是纤维素类物质热解的主要产物,黑曲霉突变株CBX－209能较好地利用该糖作为唯一的碳源和能源生长并产生有用的代谢产物柠檬酸,其效率与利用葡萄糖大致相当。利用葡萄糖氧化酶和竦根过氧化物酶复合系统测定证明该菌株不存在1,6－缩水－β－D－吡喃葡萄糖水解酶,采用快原子轰击质谱技术结合6－磷酸葡萄糖脱氢酶系统进行测定,结果表明经（NH4）2SO4沉淀或阴离子交换层析析处理后的无细胞提取液在加入ATP和Mg^2 条件下能直接催化1,6－缩水－β－D－吡喃葡萄糖合成6－磷酸葡萄糖,证明黑曲霉突变株中存在一个新酶,即1,6－缩水－β－D－吡喃葡萄糖激酶。该酶为诱导酶。     

来源于糖丝菌双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯水解酶的酶学性质表征及降解特性分析

聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate),PET]降解酶的发掘是国内外研究的热点。双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[bis-(2-hydroxyethyl)terephthalic acid,BHET]是PET降解过程的一种中间化合物,会与PET竞争酶的底物结合位点,从而抑制PET进一步降解。因此,探寻新型BHET降解酶,对进一步提高PET的降解效率具有促进作用。本研究通过基因挖掘发现了一种来源于浅黄糖丝菌(Saccharothrix luteola)参与PET降解过程的水解酶基因sle(ID:CP064192.1,5085270–5086049),其编码的蛋白质可以将BHET水解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[mono-(2-hydroxyethyl)terephthalate,MHET]和对苯二甲酸(terephthalic acid,TPA)。将BHET水解酶(Sle)通过重组质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达,结果表明,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导终浓度为0.4 mmol/L,诱导时长为12 h,诱导温度为20℃时蛋白的表达量最高。通过镍亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析3步分离纯化,获得了高纯度的Sle重组蛋白;同时对其酶学性质进行了表征,Sle最适温度和pH分别为35℃和8.0,在25–35℃和pH 7.0–9.0区间内能保持80%以上的残余酶活,且金属离子Co^(2+)能提高酶活力;进一步通过同源序列及Sle复合物结构分析得知,该酶属于二烯酸内酯水解酶(dienelactone hydrolase,DLH)家族,具备该家族典型的催化三联体,预测其催化位点分别为S129、D175和H207,并初步分析了其催化机理。最后,利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)鉴定了该酶能够特异性降解BHET生成MHET和TPA,属于BHET降解酶。本研究为生物酶法高效降解PET塑料提供了新的酶资源。     

DNA5′端~(32)P标记方法

在DNA的结构与功能研究中,其5′端~(32)P标记是常用的有效技术。下面我们从《Methods in Enzymolgy》Vol 65中摘译了DNA 5′端脱磷及~(32)P标记方法,供大家参考。 1.用磷酸单酯酶除去DNA链5′末端磷