叶黄素对人RPE细胞氧化应激损伤的保护作用

目的：外源性给予过氧化氢（H2O2）诱导构建人视网膜色素上皮细胞（Retinal pigment epithelial,RPE）细胞氧化损伤模型,探究H2O2的最佳建模浓度,并探讨叶黄素对H2O2诱导人RPE细胞氧化损伤的保护作用。方法：本研究以人RPE细胞为实验对象。不同浓度H2O2（0、50、100、200、400、600μmol/L）处理RPE细胞1 h后,观察细胞形态的改变,并测定细胞生存率和细胞内ROS浓度进而确定H2O2的最佳建模浓度。不同剂量叶黄素（1、2.5、5、7.5、10μg/mL）预处理RPE细胞24h,随后给予100μmol/L H2O2作用1h,测定各组细胞生存率和细胞内活性氧（ROS）浓度,从而评价叶黄素对RPE细胞氧化损伤的作用。结果：H2O2作用后,随H2O2浓度的增加,RPE细胞生存率逐步下降;细胞内ROS浓度随H2O2的浓度增加而显著升高。与损伤对照组相比,各叶黄素处理组RPE细胞生存率显著升高,同时细胞内ROS浓度显著下降。结论：H2O2可导致RPE细胞出现氧化应激损伤,细胞ROS含量显著增加。叶黄素干预后可显著减缓H2O2诱导的氧化应激反应,提示其可通过提高RPE细胞的生存率、抑制细胞内ROS浓度,保护RPE细胞免受氧化损伤,从而对年龄相关性黄斑变性等眼部退行性疾病起到预防和减缓作用。     

磁场对环磷酰胺杀伤人白血病细胞K562协同作用的研究初报

目的:研究不同处理时间稳恒磁场协同抗癌药物环磷酰胺对人白血病细胞K5 6 2的杀伤作用。方法:K5 6 2细胞经不同浓度的环磷酰胺和/或磁场处理12h或2 4h后,MTT法检测。数据进行统计学分析处理。结果:单纯磁场处理时,磁场对K5 6 2细胞的杀伤作用表现在2 4h(P <0 .0 1) ;环磷酰胺单纯处理K5 6 2细胞12h ,在0 .4和0 .8mg/mL浓度时对肿瘤细胞的生长没有影响(P >0 .0 5 ) ,在1.6和3.2mg/mL浓度下环磷酰胺对细胞有杀伤作用(P <0 .0 1) ;0 .4mg/mL环磷酰胺联合磁场处理K5 6 2细胞12～2 4h后,细胞活性均极显著的低于单纯环磷酰胺处理组(P <0 .0 1)。结论:9mT稳恒磁场对环磷酰胺杀伤肿瘤细胞具有一定的协同作用,磁场处理可以增加环磷酰胺的抗肿瘤效应。     

烟曲霉sho1、pbs2基因额外拷贝对几种应激能力的影响

目的构建烟曲霉额外拷贝菌株,了解额外拷贝烟曲霉sho 1、pbs 2基因能否增强菌株对高渗透压、过氧化氢(H2O2)、碱性pH、刚果红应激的抵抗能力,探讨HOG通路(high osmolarity glycerol pathway)参与的应激反应。方法用原生质体法构建分别含有烟曲霉sho 1、pbs 2基因的额外拷贝菌株,采用Real-time PCR方法检测额外拷贝株中sho 1、pbs 2的表达情况。观察并比较缺陷株、额外拷贝株对NaCl(1 mol/L)、H2O2(5 mmol/L)、刚果红(400 mg/L)及碱性pH(10.0)应激的反应。结果获得了含有烟曲霉sho 1、pbs 2基因的额外拷贝菌株MCsho1、MCpbs2,和含空白质粒的对照株Empty。额外拷贝株sho 1、pbs 2的表达水平增高,对NaCl(1 mol/L)、H2O2(5 mmol/L)、刚果红(400 mg/L)、碱性pH(10.0)应激的抵抗强于Empty。MCpbs2对这些应激的抵抗较MCsho1更显著。烟曲霉缺陷株△sho 1、△pbs 2对NaCl(1 mol/L)、H2O2(5mmol/L)、碱性pH(10.0)的敏感性高于野生株AF293。△sho 1对刚果红(400 mg/L)的敏感性高于野生株,△pbs 2对刚果红的敏感性与野生株比,无显著差别。结论额外拷贝烟曲霉sho 1或pbs 2基因能增强菌株对高渗透压、氧化压力、刚果红、碱性pH应激的抵抗能力。     

不同温、湿度下白僵菌对棉铃虫幼虫的致病力

测试了不同温、湿度下白僵菌Beauveria bassiana对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫的致病力。实验设置了10、15、20、25、30℃ 5个温度水平,用高浓度（1×10<.sup8孢子/mL）、中浓度（1×10⁷孢子/mL）、低浓度（1×10⁶孢子/mL）的白僵菌孢子液分别感染1～4龄的棉铃虫。结果表明：三个浓度处理的棉铃虫在温度为25℃时的致死中时（LT₅₀）最短,死亡速度最快,死亡率最高;高于或低于此温度时,棉铃虫的LT₅₀延长,死亡速度减慢。相对湿度发生变化时,感病棉铃虫死亡速度和死亡率明显不同。相对湿度为95%左右时,棉铃虫死亡速度最快,死亡率最高;相对湿度低于70%时,棉铃虫死亡率显著降低。     

一株白僵菌对红火蚁的毒力及对免疫酶活性与基因表达的影响

白僵菌是最具防治害虫潜力的一类昆虫病原真菌。本研究测定了球孢白僵菌Beauveria bassiana 237菌株对红火蚁Solenopsis invicta的感染毒力,并探究了白僵菌侵染对红火蚁免疫相关酶活性及相关基因表达的影响。结果显示,该白僵菌菌株对红火蚁的毒力较强,在孢子悬浮液108孢子/mL浓度下,对红火蚁的致死中时间LT50为5.288±0.2014 d;在10^4~10^8孢子/mL的不同浓度处理下,红火蚁死亡率随孢子浓度的增加而显著增加。经计算,第4~10天致死中浓度LC50值由8.82×10^6孢子/mL降低到8.95×10^5孢子/mL。红火蚁被球孢白僵菌感染后,体内保护酶和解毒酶发生了不同程度的改变。其中保护酶类酚氧化酶（PO）的活性在白僵菌处理后的第12 h已出现抑制,而在第24 h、48 h、72 h时均显著高于对照;超氧化物歧化酶（SOD）活性在12 h时与对照无显著差异,但在24~48 h阶段酶活显著上升,之后下降;过氧化物酶（POD）在较早时段保持与对照无显著差异水平,至中后期48~72 h出现持续升高。解毒酶类混合功能氧化酶系（MFO）的活性在整个检测时间段内表现为抑制-上升-抑制-上升的波动状态;谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）活性的变化与SOD相似,只在24~48 h阶段出现上升。白僵菌还导致红火蚁免疫信号通路Toll途径相关基因表达量变化。在处理后12 h,识别因子GNBP1、Spaetzle即被激活,维持上调-回调波动趋势;而信号传递因子Myd88、pelle在检测的12~72 h内基本处于被抑制状态,只有Myd88在48 h时表达量上升;转录因子Dorsal以及抗菌肽Defensin在12~24 h都已被显著激活,而在后续48~72 h被抑制。综上所述,球孢白僵菌237菌株通过调节红火蚁酶活以及免疫相关基因的表达量实现成功侵染和致病作用,具有很高的生防应用价值。     

矿质营养与其他生长物质对荷叶离褶伞菌丝生长的影响

1mg/mL KCl促进荷叶离褶伞菌丝生长;5或10mg/mL NaCl、5或10mg/mL MgSO4、5或10mg/mL KCl、10mg/mL H2PO4和1mg/mL CaSO4抑制菌丝生长;0.8mg/mL的MnSO4和CuSO4以及 0.5mg/mL FeSO4、0.2或0.5mg/mL CoCl2和0.2、0.5或0.8mg/mL ZnSO4促进菌丝生长;0.5或0.2mg/mL CuSO4、0.2或0.5mg/mL MnSO4及0.8或0.2mg/mL FeSO4对菌丝生长的影响不显著;维     

南方红豆杉盆栽扦插育苗技术研究

南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)是中国特有的国家一级保护植物。2009-2010年采用2年龄实生苗为采条母株进行室内盆栽扦插试验研究,结果表明:珍珠岩和河沙两种基质相比较,珍珠岩上生根率显著高于河沙,是更佳选择;用市售的"花语牌"快速促根剂配制成5、10、15、2 0mg/mL 4个浓度分别处理插穗基部并以蒸馏水作对照发现,10 mg/mL、15 mg/mL处理有利于生长,15 mg/mL处理后生根率显著高于5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL及对照。再以同一浓度生根粉分别浸泡4 h、8 h、10 h作对比发现,8 h和10 h处理后生长效果较好,10 h的生根率显著高于4 h、8 h。     

蛇足石杉内生真菌FS4次级代谢产物的研究

以蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)茎部来源的一株内生真菌FS4为研究对象,分别进行了分离鉴定,抑制乙酰胆碱酯酶活性试验和次级代谢产物研究。通过形态观察和18S rRNA基因序列分析,菌株FS4初步确定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。抑制乙酰胆碱酯酶试验结果表明,菌株FS4菌体的提取物具有很强抑制乙酰胆碱酯酶生物活性,在样品浓度为2 mg/mL时,抑制率为84.6%。通过对菌株FS4次级代谢产物的研究,共得到5个单体化合物(1~5),采用LC-MS、NMR等现代波谱学技术鉴定出化合物的结构分别为:麦角甾醇(1),邻苯二甲酸二辛酯(2),1'-9-12-亚油酸-2'-3'-二羟基丙酯(3),Microsphaerone C(4),烟曲霉酸(5)。其中化合物3,4和5为首次发现具有乙酰胆碱酯酶抑制活性,在0.2 mg/mL的浓度下,其乙酰胆碱酯酶抑制率分别为73.5%,84.1%和77.6%,IC_(50)值为分别为0.057、0.038、0.05 mg/mL。     

几种土壤真菌对烟粉虱的生物活性研究

B型烟粉虱Bemisia tabaci是重大入侵害虫,发展生物防治技术控制其危害具有重要意义。本研究采用浸渍法测定了9种20株土壤真菌对B型烟粉虱的室内活性,结果表明,供试菌株对B型烟粉虱都有一定致病活性,1.0±10^8 孢子/mL的分生孢子悬浮液处理10 d后,烟粉虱2龄若虫的累计校正死亡率为53%~93%,其中淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum PITS01、PlMS-12和PlMS-15菌株,以及刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae LpTS01菌株引起B型烟粉虱91%以上的死亡率。进一步测定了PITS01和LpTS01菌株对烟粉虱的毒力,结果表明PITS01和LpTS01对烟粉虱2龄若虫在处理第4天的LC50分别为2.8×10^7 孢子/mL和3.6×10^7 孢子/mL,第6天分别为1.7×10^6 孢子/mL和3.6×10^5 孢子/mL;当孢子浓度为1.0×10^7 孢子/mL时,PITS01和LpTS01菌株LT50值分别为4.4 d和4.2 d。菌株PITS01和LpTS01对烟粉虱防治具有一定的应用潜力。     

黑曲霉固态发酵生产单宁酶的条件优化

研究采用响应面法优化黑曲霉固态发酵生产单宁酶的培养条件。应用Plackett—Burman试验筛选出重要影响因子：五倍子粉含量、（NH4）2SO4浓度以及接种孢子量,最陡爬坡试验逼近最大响应区域。应用Box．Behnken响应面试验对重要影响因子进一步优化。得到最佳培养条件：每250mL三角瓶中装入1．0g五倍子粉、4．4g稻壳和0．5g麸皮、液固比（mL／g）2：1且营养盐溶液组成为（NH4）2s0421g/L、MgSO4·7H2O1g／L、NaCl1g／L,培养基pH自然,接种5．7×10^7个孢子后在30℃温度下培养4d。在此条件下,单宁酶产量从40U／g提高到114U／g,3次重复验证性试验平均值为115U／g,验证了模型的可靠性。     

中国仓鼠卵巢细胞的悬浮适应及代谢特征

目的：通过悬浮适应,使中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）获得悬浮生长的特性,并可在悬浮培养条件下较快地生长。方法：将CHO细胞以3×10^5／mL接种于100mL的三角瓶内,培养时加入1％小牛血清、1g/LPIuronic F-68、25μg／mL硫酸葡聚糖,培养体积35mL,摇床转速90r／min,每24h离心换液,当细胞增殖为2×10^6／mL时传代。结果：经过悬浮适应,细胞的平均比生长速率由适应最初的0．27／d提高为适应后的0．48／d,最大总细胞密度由适应初期的2．5×10^6／mL提高为适应后的6．3×10^6／mL,目的蛋白活性也由适应前的2781U／mL提高为适应后的8878U／mL,适应后细胞的葡萄糖平均比消耗率为1．42μmol／（10^6细胞·d）,低于适应前的2．16μmol／（10^6细胞·d）。结论：贴壁生长的CHO细胞经过悬浮适应,不仅可以在悬浮培养条件下快速生长,而且细胞对葡萄糖的利用率也得到提高。     

原生质体紫外诱变选育竹红菌甲素高产菌株

采用原生质体紫外诱变技术选育竹红菌甲素高产菌株。结果表明:以竹黄菌Shiraia sp.S8为出发菌株,当使用混合酶系(5 mg/mL纤维素酶和10 mg/mL蜗牛酶)在30℃处理菌丝2 h,获得菌丝原生质体3.24×106个/mL。以竹黄菌原生质体在距离15 W紫外灯30 cm处照射诱导,获得诱变菌株C6。其竹红菌甲素产量达到28.1 mg/L,比原始出发菌株提高了53.7%,且遗传稳定,具有较高的医药与工业应用价值。     

特比萘芬对24株黑酵母样真菌的体外药敏试验研究

目的 评价特比萘芬对7个属24株刺盾霉目（Chaetothyriales）黑酵母样真菌体外敏感性.方法 应用美国国家临床和实验室标准研究所（CLSI）的M38-A2方案.菌悬液终浓度为（0.4 ～5）＆#215;104 CFU/mL,30℃孵育5～7d,测定最低有效浓度（MEC）和最低抑菌浓度（MIC）.结果 特比萘芬对24株黑酵母样真菌MEC范围：0.125 ～4μg/mL,MEC90∶2μg/mL,MEC50∶0.25 μg/mL,GM∶0.392 9 μg/mL,特比萘芬对5株暗色真菌100％生长抑制,MIC范围：1～4 μg/mL,MIC50∶2μg/mL,MIC90∶4μg/mL.结论 特比萘芬对刺盾霉目（Chaetothyriales）中的黑酵母样真菌有较强的抑制作用,50％抑菌作用明显.     

TF-1细胞增殖法测定神经生长因子生物学活性的建立与应用

目的：建立并优化用于检测神经生长因子（NGF）生物学活性的TF-1细胞增殖法,并应用于重组人NGF和鼠NGF制品的活性检测。方法：将梯度稀释的人NGF国际参考品与TF-1细胞相作用,通过MTT法测定细胞增殖情况,建立测定NGF活性的TF-1细胞增殖法;从粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（CM-CSF）残留、NGF加样稀释率、TF-1细胞接种浓度、培养时间等多个环节对实验条件进行优化;将建立的TF-1细胞增殖法应用于重组人NGF和鼠NGF的活性检测。结果：建立了用于NGF活性检测的TF-1细胞增殖法;实验条件优化结果表明,在无GM-CSF残留的情况下,将稀释至1／4的NGF样品与4×10^5／mL的细胞相互作用,培养48h,可以得到更为典型的的四参数曲线;利用条件优化后建立的检测方法对重组入NGF和鼠NGF各2批样品分别进行4次测定,结果平均值分别为10．01×10^5、10．81×10^5和3．55×10^5、3．30×10^5U／mg,变异系数分别为7．5％、7．2％和7．2％、9．1％,检测结果稳定均一,表明检测方法具有很好的重复性。结论：建立并优化了用于NGF活性检测的TF-1细胞增殖法,该方法操作简便、定量准确、重复性好、稳定可靠,可有效应用于人NGF和鼠NGF制品的活性检测。     

两种萤火虫荧光素酶活性检测方法的一致性比较

目的：比较2种萤火虫荧光素酶活性检测方法的一致性。方法：分别采用化学发光技术（Che）及活体光学成像技术（Bio）,从细胞和动物水平检测在转染以萤火虫荧光素酶为报告基因的载体pCI-AAA-Fluc-neo后不同时间点,萤火虫荧光素酶的表达强度。结果：在细胞和动物水平,萤火虫荧光素酶的表达强度均随时间推移逐步递减。在HepG2细胞,萤火虫荧光素酶表达持续96h,活性从24h的2781±220mV（1．6×10^6±2．3×10^5光子）降至96h的49±3．5mV（6．4×10^4±2．5×10^4光子）。在动物水平得到相似的结果,BALB／c小鼠萤火虫荧光素酶表达持续20d,其活性从1d的16592±409mV（1．9×10^8±3．6×10^6光子）降至20d的798±139mV（3．37×10^5±3．8×10^4光子）。通过一致性检验,2种检测方法在细胞和动物水平的直线回归方程分别为lgChe=1．186·lgBio-3．764（r=-0．937,P〈0．001）和lgChe=0．451·lgBio＋0．64（r=0．915,P〈0．001）;进一步将理论数据与实验数据进行配对t检验,二者无统计学差异（P〉0．05）。结论：2种检测方法是一致的;从整个实验过程来看,活体光学成像技术较化学发光法更为简便、直观,可量化地对同一个体连续检测,减少了个体间差异和实验动物用量。     

地塞米松对腰硬联合麻醉剖宫产术后腰背痛及神经并发症影响

目的：硬膜外腔注射地塞米松对腰硬联合麻醉腰背痛及神经并发症的预防效果。方法：将200例ASA I-II腰联合麻醉下择期剖宫产患者随机分成2组,A组吗啡2 mg＋生理盐水稀释至10ml硬膜外腔注射;B组向硬膜外腔注射吗啡2mg＋地塞米松5mg＋生理盐水稀释至10 ml硬膜外腔注射。术毕两组均行静脉术后镇痛。观察并记录患者术后24,72 h的腰背痛及神经并发症情况,同时记录每例患者试穿次数。结果：B组患者术后24,72 h的背痛发生率为11.0%,4.0%,明显低于A组（P〈0.05）;穿刺1次和2次及以上背痛的发生率分别为5.1%和19.5%,明显低于A组（P〈0.05）。两组72h内神经并发症差异无统计学意义。结论：硬膜外腔注射地塞米松有效预防腰硬联合麻醉剖宫产术后腰背痛,但对神经并发症的影响还有待进一步观察。     

ERK1／2信号通路对黄芪苷Ⅳ抗H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤的作用

目的：研究黄芪苷Ⅳ（AST）是否通过细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）通路发挥对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用。方法：用200μmoL／L的H2O2处理细胞6h,采用MTT法检测细胞存活率,建立H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤模型;比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、总超氧化物歧化酶（T—SOD）和锰超氧化物歧化酶（Mn—SOD）活力以及丙二醛（MDA）含量;Western blot检测H9c2细胞ERK1／2蛋白的磷酸化水平。结果：在H2O2浓度为200μmol／L作用6h条件下,细胞存活率降低程度适中,实验结果重复性好,确定后续实验采用200μmol／L H2O2作用6h建立模型。与H2O2组比较,10mg／L及20mg／L AST均显著提高细胞存活率（P〈0．01）,使细胞培养液中LDH活性显著降低（P〈0．01）,T—SOD及Mn—SOD活力显著提高（P〈0．01）,MDA含量显著降低（P〈0．01）。10mg/L及20mg/L AST均显著增加H2O2损伤的H9c2细胞p—ERK1／2蛋白的表达（P〈0．01）,当用PD98059（ERK1／2的抑制剂）预处理后,AST的作用则被取消。结论：黄芪苷Ⅳ可以通过ERK1／2通路发挥对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用。     

抗胆汁螺杆菌单克隆抗体的制备

目的制备抗胆汁螺杆菌单克隆抗体（McAbs）。方法用胆汁螺杆菌B2m株皮下免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行融合。以酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选抗胆汁螺杆菌单克隆杂交瘤细胞株并初步鉴定其特异性;免疫印迹试验测定单抗所结合的抗原表位;免疫双向扩散试验确定IgG亚类;腹腔接种法、辛酸-硫酸铵盐析法大量制备、纯化单克隆抗体。结果经过ELISA筛选获得11个阳性杂交瘤细胞株,其效价最高达1：4×10^5以上,并与实验动物常见的15种病原菌呈阴性反应;IgG亚类为IgG2a和IgG2b;免疫印迹试验显示,6株（A-F）与胆汁螺杆菌大约相对分子质量（172、0、21、30、52、66）×10^3的抗原特异结合,5株（G-K）皆与胆汁螺杆菌、幽门螺杆菌等三种螺杆菌大约相对分子质量（52、82）×10^3的抗原呈阳性反应,表明A-F株针对的是胆汁螺杆菌特异性抗原,G-K株可能具有属特异性。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,所结合的抗原为胆汁螺杆菌或螺杆菌的免疫优势抗原,为进一步的种、属生物学特性研究、菌株分型及血清学检测方法建立等奠定了基础。     

兔眼增殖性玻璃体视网膜病变模型的建立

目的探讨兔眼增殖性玻璃体视网膜病变模型的建立方法。方法①体外培养兔眼视网膜色素上皮细胞;②兔眼3组,每组6只,分别在玻璃体内注射0.1 mL的生理盐水、1×106细胞及2×106细胞,在不同时间段进行裂隙灯显微镜、间接检眼镜、眼底照像和B超检查,观察成模情况。结果注射后28 d,生理盐水组成模0眼;1×106细胞组成模5眼,其中Ⅰ级眼1只,Ⅱ级眼3只,Ⅲ级眼1只;2×106细胞组成模6眼,其中Ⅱ级眼2只,Ⅲ级眼4只。结论兔眼玻璃体内注射2×106同种视网膜色素上皮细胞建立增殖性玻璃体视网膜病变模型,符合病变发展规律,而且稳定可靠,成模较快,简单易行。