人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的:构建人胱硫醚β合成酶(human cystathionineβ-synthase,hCBS)基因原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法:以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因(基因bank号:BT007154.1)完全一致,转入E.coli BL21(DE3)中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果:经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS(rhCBS)。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS(约19 mg/L培养物),并测得其比活力约为57 kU/g。结论:成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。     

hrpZ基因在大肠杆菌中的高效表达与活性检测

PCR扩增hrpZ基因片段,克隆到pGEM-T载体中,经EcoRI／Xho1酶切、连接将hrpZ基因插人大肠杆菌表达载体pET32b（＋）硫氧还蛋白下游,构建重组表达质粒pET-hrpZ,再将其转化至E．coli BL21（DE3）中,经筛选得到阳性克隆子,IPTG诱导表达HrpZ蛋白。SDS-PAGE显示,目的蛋白在重组菌株中得到了可溶性高效表达。该重组蛋白分子量为55．8kD,与理论值大小相符。采用叶片穿刺法,融合蛋白具有诱导烟草过敏反应的生物功能。     

猪源戊型肝炎病毒基因IV型ORF3编码蛋白的表达及鉴定

通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF3全基因,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a（+）,构建pET28a-ORF3表达载体,转入E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达。Ni-NTA层析柱纯化表达蛋白,用SDS-PAGE、免疫印迹、ELISA等方法分析鉴定表达产物。结果成功扩增到345 bp的目的基因;构建了重组表达载体pET28a-ORF3;转化宿主菌E.coli BL21 (DE3)后表达产物的相对分子质量在6.50~16.5 kDa之间,与预期表达的目的蛋白相对分子质量相符;表达的目的蛋白能与阳性猪源和人源血清发生特异性反应,证实其具有较好的反应原性。     

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20（b）中构建成质粒pET—amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20（b）中构建成质粒pET—amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET—amyAⅠ中构建成质粒pET—amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E．coli JM109（DE3）,并将重组质粒pET—amyAⅠ转化E．coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL。通过IPTG诱导测酶活性：在E．coli JM109（DE3）中表达的重组酶（pET—amyA）、（pET—amyAⅠ）、（pET—amyAⅡ）的酶活分别是1658．0U／mL、6721．7U／mL、8904．5U／mL,在E．coil BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中表达的重组酶（pET—amyAⅠ）的酶活是13867．7U／mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3）,摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。     

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2的表达纯化及活性鉴定

组织基质金属蛋白酶抑制剂-2 (TIMP-2) 抑制肿瘤迁移及侵袭。文中以人TIMP-2为研究对象,探索人TIMP-2蛋白的原核表达特征,并进行纯化及活性鉴定。以人肺癌A549细胞的总RNA反转录得到的cDNA为模板,克隆人TIMP-2基因,构建pET28a重组表达载体;经酶切检测和测序分析的重组表达载体pET28a-TIMP-2转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导表达,并对表达条件进行优化。经镍亲和柱纯化后,用Western blotting法鉴定融合蛋白His-TIMP-2,并用明胶酶谱法检测融合蛋白的活性。研究发现融合蛋白His-TIMP-2在E. coli BL21(DE3) 中以包涵体的形式存在;在一定范围内,IPTG浓度对His-TIMP-2的表达量没有显著影响;而在该表达系统中,诱导温度和时间是关键参数,His-TIMP-2的表达量随诱导温度升高而增加;纯化并复性后的融合蛋白His-TIMP-2能有效抑制人肺癌A549细胞表达的基质金属蛋白酶的活性。具有活性的融合蛋白的获得为后续深入研究人TIMP-2的功能及机制奠定基础,并对肿瘤治疗具有重要意义。     

构建羰基还原酶基因工程菌生物转化产l-麻黄碱

以筛选得到的Morganella morganii J-8细菌的基因组为模板,通过PCR扩增得到目的基因mdlh2。核苷酸序列测定结果表明,基因全长1046bp。以pET28a（＋）为表达载体,构建重组质粒pET28a（＋）-mldh2,并在E．coli BL21（DE3）中表达。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（简称MAK）产l-麻黄碱的活力。进一步考察了诱导时间和IPTG浓度对重组菌表达的羰基还原酶的影响,37℃下用0．5mmoL／L的IPTG诱导4h,重组羰基还原酶的酶活达到0．2U／mg蛋白,转化液中l-麻黄碱质量浓度达到45mg／L。     

非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段（vp73l）。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21（DE3）,经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coli BL2（DE3）高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。     

月季eIF－5A基因的表达增强宿主大肠杆菌对高温和低温的耐性

真核生物翻译起始因子（eIF－5A）是在调控生物生长发育、衰老与环境响应中起重要作用的蛋白质。设计eIF－5A基因的兼并引物,对月季受高温诱导的叶片cDNA进行PCR扩增,获得特异性片段回收、克隆和测序,确定该cDNA为月季eIF-5A(命名为RceIF5A),含有480bp的核苷酸,编码159个氨基酸。将该cDNA序列克隆到原核表达载体PET32a中,获得重组子pET32a－eIF5A。高温（50℃）和低温（4℃）胁迫下含有该基因的大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (pET32a-eIF5A)比E. coli BL21 (pET32a)有明显的抗性提高,据此认为含有重组子的E. coli BL21 (pET32a-eIF5A)对高低温的抗性可能与eIF-5A基因的表达相关。该基因的GeneBank登录号为 EF177192。     

大肠杆菌O157:H7的sRNA伴侣蛋白Ufq的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的sRNA伴侣蛋白Hfq.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出基因hfq,并插入含6xHis标签序列的原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中,构建重组表达质粒pET28a(+)-hfq,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)...     

信号肽对短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响

从Brevibacterium sp．DGCDC-82染色体DNA中扩增出含信号肽序列的胆固醇氧化酶结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a（＋）中,构建重组质粒pET28a—COD（s＋）。以pET28a-COD（s＋）为底物,扩增出不含信号肽的胆固醇氧化酶结构基因,构建成重组质粒pET28a-COD（s-）。两种重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）通过IPTG诱导均获得活性表达,SDS-PAGE分析,目的产物表达量都占到了细胞总蛋白的50％以上,Brevibacterium sp．DCR2DC-82胆固醇氧化酶的信号肽对重组酶的空间构象和表达量并没有太大的影响。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的：构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法：通过佛波酯（TPA）和植物球血凝素（PHA）刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a（＋）中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果：酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a．IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论：成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

人β神经生长因子基因稀有密码子及mRNA二级结构对其在大肠杆菌中表达的影响

目的:研究人β神经生长因子(β-NGF)基因中稀有密码子及其mRNA二级结构对其在大肠杆菌中表达量的影响。方法:根据对人β-ngf中稀有密码子及其mRNA二级结构的研究,同义突变人β-ngf基因,通过PCR得到人β-ngf的5’端同义突变基因rh-β-ngfp32和全同义突变基因rh-β-ngfmu,将这2个序列克隆入载体pET3a中,得到重组质粒pET3a-ngfp32和pET3a-ngfmu,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达,收集菌体,SDS-PAGE检测其表达量的改变。结果:构建的pET3a-ngfp32和pET3a-ngfmu表达载体酶切和测序结果正确,SDS-PAGE结果显示,与在重组菌pET3a-NGF总蛋白中的表达量相比,目的蛋白rh-β-NGF在重组菌pET3a-NGFP32和pET3a-NGFmu中的表达量均明显增高,并且在重组菌pET3a-NGFmu中的表达量高于重组菌pET3a-NGFP32。结论:目的蛋白rh-β-NGF在重组菌pET3a-NGFP32和pET3a-NGFmu中表达量的增高,说明人β-ngf基因中稀有密码子和mRNA的二级结构对其在大肠杆菌中的表达有较为明显的影响,结果为构建rh-β-NGF的大肠杆菌工程菌株奠定了基础。