热CO2气腹处理后结肠癌细胞株COLO 205的蛋白组学变化

目的:研究热CO₂气腹处理后结肠癌细胞株COLO 205的蛋白组学变化,为阐明热CO₂气腹对结肠癌细胞的杀伤作用机制提供依据。方法:用热CO₂气腹处理结肠癌细胞株COLO 205,按有无处理分为处理组与对照组。分别抽提两组细胞的总蛋白质,采用同位素标记的相对和绝对定量（isobaric tags for relative absolute quantitation,iTRAQ）技术标记,液相色谱（LC）分离蛋白质,质谱仪（MS）进行蛋白质鉴定及Western b1ot检测。结果:共筛选得到18个差异表达的蛋白,其中8个蛋白表达上调,10个蛋白表达下调。Western blot显示热休克蛋白HSP70在细胞表达明显高于对照组（P<0.01）;蛋白Myosin-9的表达量在处理后显著下降。结论:热CO₂气腹处理后结肠癌细胞株COLO 205的蛋白组学发生差异性变化。     

胰岛素样生长因子1（IGF-I）通过PI-3K/Akt途径对结肠癌细胞凋亡的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-I）通过磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI-3K/Akt）信号通路对结肠癌细胞株SW480凋亡率的影响及其凋亡抑制蛋白survivin表达水平的变化。方法：培养结肠癌SW480细胞株,实验分成三组：未加IGF-I空白组、IGF-I刺激组、IGF-I＋LY294002阻断组,检测阻断剂LY294002是否阻断PI-3K/Akt通路（Western Blot检测三组P-Akt表达情况）;Western Blot及免疫荧光观察三组survivin蛋白表达变化;MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果：Western blot结果显示LY294002可抑制IGF-I诱导的p-Akt的表达（P〈0.05）;阻断IGF-I诱导的PI-3K/Akt通路后MTT显示结肠癌细胞SW480增殖抑制率升高（P〈0.05）,流式细胞术分析显示凋亡率明显上升（P〈0.05）;Western blot及免疫荧光结果显示LY294002可抑制IGF-I诱导的survivin的表达（P〈0.05）。结论：IGF-I可通过PI-3K/Akt通路诱导survivin表达,从而抑制结肠癌细胞SW480的凋亡。     

PIG11与热休克蛋白60的相互作用介导肝癌HepG2细胞凋亡

为了探讨候选肝癌抑癌蛋白PIG11(p53-induced gene 11,PIG11)诱导细胞凋亡的机制,首次在HepG2细胞株中鉴定了11个PIG11结合蛋白,热休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)为其中之一．采用免疫共沉淀联合Western blot 技术对Hsp60进行了验证．用Western blot检测其蛋白质表达,结果显示：pLXSN-PIG11-HepG2细胞中Hsp60蛋白表达较pLXSN-HepG2、HepG2细胞组下调(n=3,P < 0.01)．选取与Hsp60关系密切的Bax蛋白进行研究,Western blot结果显示PIG11高表达可引起胞浆Bax向线粒体转位．以上结果表明,PIG11蛋白能与HepG2细胞中的Hsp60结合,促进Hsp60-Bax的分离,引起Bax从胞液到线粒体转位,激活线粒体凋亡途径,这可能是其诱导HepG2细胞凋亡的主要机制之一．     

HAX-1抑制过氧化氢诱发的乳腺癌细胞MCF-7凋亡

目的：应用RNA干扰（RNAi）技术特异地干扰HAX-1在乳腺癌细胞MCF-7中的表达,研究其在过氧化氢诱导的细胞凋亡中的作用。方法：应用载体pSR-GFP／Neo构建针对HAX-1基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒;转染MCF-7细胞,G418筛选稳定细胞系,Western blot鉴定筛选的细胞克隆;用流式细胞仪检测筛选的细胞系在过氧化氢条件下的凋亡率。结果：电泳和测序证实合成的siRNA序列正确并准确克隆到pSR-GFP／Neo载体中;Western blot证实获得MCF-7／HAX-1 siRNA稳定细胞株,其HAX-1蛋白水平降低95％左右;用1mmol／L过氧化氢处理获得的稳定细胞株8h,细胞凋亡率明显高于对照组。结论：HAX-1能够保护乳腺癌细胞MCF-7免于过氧化氢诱导的细胞凋亡。     

低氧预适应对氧糖剥夺损伤SH-SY5Y细胞的保护作用

目的：观察低氧预适应（HPC）对氧糖剥夺（OGD）损伤人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的保护作用,并探讨其可能机制。方法：SH-SY5Y细胞随机分为4组：正常对照组：常规培养,不进行OGD处理;HPC处理组：将神经元放入低氧培养箱内（2% O₂）,30 min后立即取出,再恢复常氧培养,反复5次;OGD组：无糖培养基、低氧培养箱内（1% O₂）处理细胞10 h,然后复氧复糖培养24 h;HPC+OGD处理组：细胞HPC后,行OGD处理。通过形态学观察,MTT比色法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）漏出量判断细胞损伤的程度,原位末端标记（TUNEL）法检测凋亡水平,Western blot检测Caspase 3、低氧诱导因子1α（HIF-1α）的蛋白表达。结果：HPC可减轻OGD引起的SH-SY5Y细胞凋亡,降低LDH漏出量,明显增加OGD组SH-SY5Y细胞的活力（P<0.05）。Western blot显示HPC+OGD组Cas-pase 3蛋白的表达明显低于OGD组（P<0.05）;HIF-1α蛋白的表达明显高于OGD组（P<0.05）。结论：HPC对体外培养的SH-SY5Y细胞OGD损伤具有保护作用,其机制可能与上调HIF-1α蛋白有关。     

高表达蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST促进HepG2肝癌细胞体外增殖

为深入探讨蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST在肝癌中的作用, 构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1/ PTP-PEST并转染HepG2肝癌细胞, 经荧光定量RT-PCR和Western blot对转染细胞进行筛选, 选出稳定高表达PTP-PEST基因的细胞株, 并采用MTT及Western blot对高表达PTP-PEST基因的细胞株的增殖速度和生长因子受体结合蛋白2表达量进行检测, 观察到高表达PTP-PEST的细胞株内Grb2蛋白表达上调, 细胞增殖速度加快. 本研究表明, 在HepG2肝癌细胞株内, PTP-PEST可能通过影响Grb2蛋白的表达来促进细胞增殖.     

RNA干扰HIF-1α影响宫颈癌HeLa细胞上皮细胞间质变标记蛋白的研究

目的 通过RNA干扰技术沉默人宫颈癌HeLa细胞缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的表达,在细胞水平研究HIF-1α对宫颈癌HeLa细胞上皮细胞-间质变标记蛋白（E-cadherin,N-cadherin,vimentin）表达的影响.方法 将人宫颈癌HeLa细胞株（H0细胞）、转染pGenesil-1空白质粒的HeLa细胞株（H1细胞）及转染HIF-1α-shRNA质粒的HeLa细胞株（H2细胞）分别行常氧及缺氧（150 μmol/L CoCl2培养12 h）培养,应用Western印迹、免疫细胞化学法检测每组HeLa细胞中HIF-1α、上皮标记蛋白E-cadherin、间质标记蛋白vimentin、N-cadherin的表达情况.结果 Western印迹分析各缺氧组HIF-1α、E-cadherin、vimentin及N-cadherin的平均光密度值,免疫细胞化学显示H0细胞、H1细胞缺氧时HIF-1α、N-cadherin、vimentin蛋白高表达,而E-cadherin低表达,H2细胞在乏氧时HIF-1α、N-cadherin、vimentin蛋白表达显著减弱,而E-cadherin高表达.结论 通过shRNA干扰抑制人宫颈癌HeLa细胞HIF-1α,可一定程度上抑制乏氧环境中宫颈癌HeLa细胞上皮细胞-间质变.     

热疗对SW1990 胰腺癌细胞上皮间质转化（EMT）的影响及其作用机制

目的：探讨热疗对化疗诱导的人胰腺癌细胞株SW1990 细胞上皮间质转化（EMT）的影响及其可能的作用机制。方法：分别 用不同浓度吉西他滨(0, 5, 10, 20,30 滋M)作用于SW1990 细胞不同时间(24, 48, 72 小时)及30 滋M 吉西他滨作用24h 联合热疗 43℃ 1h,观察细胞的形态学变化,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT) 法检测细胞的增殖情况。采用Western blot 方法检测细胞内 E-cadherin 蛋白和剪切的Notch1 蛋白的表达。结果：①吉西他滨在一定浓度范围内可明显抑制SW1990细胞的增殖（P<0.05）,并 呈浓度和时间依赖性。吉西他滨作用前24 h 给予43℃ 1h热疗预处理可显著增强吉西他滨对SW1990细胞的抑制作用（P<0.05） ②吉西他滨作用SW1990 细胞24 小时后,细胞数目减少,细胞形态变大,细胞呈梭形,且细胞间连接减少;而热疗预处理的联合 能够逆转此种形态学变化。③吉西他滨作用24 小时后,细胞内E-cadherin蛋白的表达下调、Cleaved Notch1 的蛋白表达上调,热 疗预处理可明显上调吉西他滨诱导的E-cadherin 蛋白表达下调、并下调Cleaved Notch1 蛋白表达的上调。结论：热疗预处理显著 逆转吉西他滨所诱导的人胰腺癌细胞株SW1990 细胞的EMT 现象,其机制可能与Notch 信号通路有关。     

beta榄香烯对人脑胶质瘤SHG44 细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨中药提取物beta- 榄香烯对胶质瘤SHG44 细胞增殖抑制作用及对Bax 和Bcl-2 蛋白表达的影响,并进一步探讨发 生的机制。方法：用不同浓度的beta-榄香烯对体外培养的SHG44 细胞进行干预,分别采用MTT、流式细胞仪检测法,观察beta-榄香 烯对SHG44细胞增殖的抑制和凋亡诱导作用,并通过Western blot检测凋亡相关蛋白Bax 与Bcl-2 蛋白表达情况。结果：经beta- 榄香烯处理SHG44细胞后,MTT 结果其发现SHG44细胞生长受药物浓度和时间的影响,细胞生长明显被抑制,且（P<0.05）,流 式细胞术显示,茁- 榄香烯诱导SHG44细胞后,细胞凋亡指数伴随药物作用时间的延长凋亡显著增加;Western blot 结果发现,beta- 榄香烯对SHG44 细胞的诱导后,使促凋亡蛋白Bax 和抑凋亡蛋白Bcl-2 与对照组相比发生了显著改变,且实验组Bax 蛋白表达 明显高于对照组,而抑凋亡蛋白Bcl-2 的表达伴随beta- 榄香烯的作用时间的增加,表达也逐渐减少。结论：beta- 榄香烯能显著抑制胶 质瘤SHG44 细胞的增殖,促进其凋亡;其机制可能与调控Bcl-2 和Bax表达有关。     

热疗联合奥沙利铂对SW480细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察奥沙利铂联合热疗对人结肠癌细胞SW480增殖及凋亡的影响,确定联合用药的效果,为临床方案提供参考。方法:采用MTT(四唑盐)法检测热疗、奥沙利铂及联合用药对细胞增殖的影响;瑞士吉姆萨染色法观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞凋亡和周期;Western blot检测Bax、Bcl-2以及Caspase8蛋白表达量变化;q PCR检测Bax、Bcl-2以及Caspase8 m RNA的积累。结果:热疗联合奥沙利铂可以显著抑制细胞增殖,与对照组相比,热疗组、化疗组、联合组细胞凋亡率分别为16.2%、20.5%和36.1%,具有显著性差异(P0.01);细胞学形态中,热疗组细胞发生皱缩,化疗组细胞膜破裂;化疗将细胞阻滞在G2/M期,热疗和联合组将细胞阻滞S期;Western blot和qPCR显示Bax/Bcl-2比值上升,Caspase8表达量增加,联合组三种蛋白的表达量均与对照组具有显著性差异(P0.01)。结论:热疗联合奥沙利铂可以显著促进细胞凋亡,提高治疗效果,为结肠癌的治疗提供参考。     

宫颈腺癌发生相关蛋白的蛋白质组学初步研究

目的：为了研究宫颈腺癌和正常宫颈组织的差异表达蛋白,为宫颈腺癌的发生和早期诊断提供有意义的生物标志物。方法：以正常宫颈组织和宫颈腺癌组织为研究对象,提取组织总蛋白,依次进行二维凝胶电泳,凝胶图象分析,基质辅助激光解吸附／离子化飞行时间质谱及生物信息学分析。Western Blot方法验证部分蛋白表达情况。结果：建立了宫颈腺癌和正常宫颈组织的二维电泳图谱,进行质谱和生物信息学分析比较鉴定宫颈腺癌和正常宫颈组织差异表达蛋白7个,与正常宫颈组织比较,宫颈腺癌表达降低的蛋白有3个,包括抑制素（inhibin-beta）,PTEN,乳铁蛋白（lactoferrin）;宫颈腺癌表达升高的蛋白有4个,包括谷胱甘肽S-转移酶（GSTT1＊0）,Homeodomain—interacting protein kinase2（HIPK2）,CD44v5,galectin-7。Western Blot方法检测结果显示inhibin-beta和PTEN在宫颈腺癌中表达变化情况与蛋白质组学结果一致。结论：宫颈腺癌和正常宫颈组织存在差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能是宫颈腺癌发生相关蛋白,可能作为宫颈腺癌早期诊断的标志物。     

PDIA1和EF1D在左侧和右侧结肠癌差异表达的实验研究

目的：初步确定蛋白质二硫化异构酶A1和延伸因子1-delta为左侧和右侧结肠癌中差异表达蛋白,为左侧和右侧结肠癌在肿瘤生物学方面的差异提供分子遗传学依据。方法：收集人左侧结肠癌（LSCC）和右侧结肠癌（RSCC）组织标本,进行二维凝胶电泳、质谱分析和生物信息学分离和鉴定左右侧结肠癌中差异表达蛋白质,进一步应用RT—PCR、WesternBlot和免疫组织化学技术检测蛋白质二硫化畀构酶A1和延伸因子1-delta在左侧和右侧结肠癌中的表达状态。结果：筛选并成功鉴定出左侧和右侧结肠癌中16种差异表达蛋白质,与右侧结肠癌比较,lO种蛋白在左侧结肠癌表达上调,6种蛋白在左侧结肠癌表达下调,其中蛋白质二硫化异构酶A1在左侧结肠癌中表达上调,延伸因子1-delta在左侧结肠癌中表达下调,并通过RT-PCR、Western Blot和免疫组化方法证实了在左侧和右侧结肠癌中该两种蛋白表达的差异,与蛋白质组学结果一致。结论：左侧结肠癌和右侧结肠癌的蛋白质组存在差异,其中蛋白质二硫化异构酶A1和延伸因子1—delta在mRNA和蛋白水平均存在差异,这些可能是左侧和右侧结肠癌生物学行为差异的原因。     

拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ和人 N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的原核表达及其多克隆抗体制备

目的：在大肠杆菌中分别重组表达拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ（ATMDSI）和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I（HsGnTI）,制备其多克隆抗体,为基因表达鉴定提供检测抗体。方法：用PCR方法克隆ATMDSI、HsGnTI基因片段,连接至pBV220表达载体后转化大肠杆菌DH5α,获得表达菌株,通过42℃升温诱导表达,制备纯化ATMDSI和HsGnTI;纯化的蛋白以80μs／ks的剂量免疫大耳白兔,经3次免疫后,采集血清制各其相应的多克隆抗体;采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果：获得ATMDSI和HsGnTI基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pBV220-ATMDSI、pBV220-HsGnTI,在大肠杆菌中表达了重组ATMDSI和HsGnTI,SDS-PAGE分析显示其相对分子质量分别为45．3×10^3和46．9×10^3,与理论值一致;用纯化的蛋白免疫大耳白兔后制备了抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体,Western印迹结果证明该抗体具有较高的特异性。结论：获得了特异性较高的抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体血清,为甘露糖苷酶Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的研究提供了检测抗体。     

带myc标签的人造血相关PBX相互作用蛋白真核表达载体的构建及其功能研究

目的:构建带myc标签的造血相关PBX相互作用蛋白(HPIP)的真核表达载体,获得myc-HPIP融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的pcDNA3.0-HPIP质粒为模板,采用PCR技术扩增HPIP编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,通过Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人肝癌HepG2细胞,通过Western印迹检测其对AKT、ERK信号通路中AKT、ERK磷酸化水平的影响。结果:双酶切和测序结果表明myc-HPIP真核表达质粒构建成功,转染HepG2细胞后表达了myc-HPIP融合蛋白;Western印迹证明myc-HPIP可升高AKT、ERK的磷酸化水平。结论:构建了带myc标签的人HPIP真核表达载体,为进一步研究HPIP在肿瘤发生发展中的功能奠定了基础。     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的人激活转录因子5（ATF5）的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在蛋白和mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高roTOR的转录和蛋白水平。结论：构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

Ezrin在化疗敏感性不同大B细胞淋巴瘤中表达的实验研究

目的：比较化疗敏感性不同弥漫性大B细胞淋巴瘤的蛋白质表达差异,寻找可反映大B细胞淋巴瘤化疗敏感性的标志物。方法：通过肿瘤药物敏感试验选取化疗高敏感性和低敏感性大B细胞淋巴瘤组织,进行蛋白质组学比较研究后得出差异表达蛋白;对在高敏感组中高表达的埃兹蛋白（Ezrin）进一步行免疫印迹验证,应用免疫组化技术检测在临床病例中的表达情况。结果：建立了化疗高敏感和低敏感大B细胞淋巴瘤差异表达蛋白质凝胶2D图谱,鉴定了28种差异表达蛋白,发现Ezrin蛋白在化疗高敏感组表达高于低敏感组,免疫印迹和免疫组化结果也进一步证实了Ezrin的这一表达状态。结论：Ezrin蛋白表达在化疗敏感性不同大B细胞淋巴瘤中存在差别,可能作为预测淋巴瘤化疗敏感性的候选标志物。     

应用二维电泳和质谱技术筛选喉癌及癌旁组织中的差异表达蛋白质

目的分离并鉴定喉癌和癌旁正常粘膜组织的差异表达蛋白质,为喉癌早期临床诊断、治疗提供新的有关的肿瘤生物学标记和靶标。方法收集5对人喉癌组织和对应的癌旁正常粘膜组织,提取组织总蛋白质,采用二维凝胶电泳技术分离蛋白并进行比较。选择在喉癌中明显差异表达的蛋白质点,进行质谱分析。结果获得了分辨率和重复性均较好的凝胶蛋白图谱。筛选出的在喉癌及癌旁正常粘膜组织中明显差异表达的10个蛋白质点,并成功鉴定。其中在喉癌组织中高表达的7个,低表达的3个。结论喉癌组织与癌旁正常粘膜组织蛋白存在明显的差异,筛选并鉴定出的这些蛋白质可能成为喉癌早期临床诊断、治疗的标志物和靶标。     

羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后线粒体疏水蛋白质组的定量分析

抗癌剂羟基喜树碱可以通过线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡.应用定量蛋白质组学技术分析羟 基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体疏水蛋白质差异表达,探讨癌细胞凋亡机制及羟基 喜树碱的抗癌机理.分离提取羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体,并采用顺序抽提法提取疏水蛋白质;用含稳定同位素亲和标签的c-ICAT试剂标记蛋白,利用基于多维色谱线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用技术的鸟枪(shotgun)法策略分析鉴定了在肝癌细胞凋亡前后的线粒体中表达量差异有显著统计学意义(P<0.05)的疏水蛋白144种,其中, 12种蛋白的表达量在凋亡细胞中下调,而表达量在羟基喜树碱诱导细胞凋亡后上调10倍以上的蛋白43种.这些蛋白主要与细胞分裂增殖、分化凋亡、能量代谢、核酸代谢以及信号转导相关.该研究结果为在亚细胞定量蛋白质组水平上深入探讨羟基喜树碱的作用机理提供了新的实验依据,亦为研究肿瘤细胞凋亡机制提供了新的思路.