miR-143 通过抑制PTN 促进人骨髓间充质干细胞成脂分化

目的:研究miR-143调控人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成脂分化的新机理。方法:将NC、miR-143、siPTN、miR-143i转入hMSCs中,诱导成脂分化,检测miR-143对成脂分化的影响。经miRNA靶点分析软件Findtar预测出miR-143在人多效生长因子(hPTN)的3’-UTR端有靶点。RT-PCR、western blot研究miR-143与hPTN的关系。构建hPTN 3’-UTR靶位点荧光检测质粒prltk-PTN及其突变质粒prltk-m,验证miR-143是否在人PTN 3’-UTR上有靶点。结果:miR-143促进hMSCs成脂分化,抑制hPTN的mRNA和蛋白表达水平。荧光报告实验证实miR-143在人PTN的3’-UTR上有靶点。结论:miR-143通过与hPTN3’-UTR上的靶点相结合而抑制hPTN的表达,从而促进了hMSCs成脂分化进程。     

miR-148a在5-aza诱导间充质干细胞心肌样分化中的调控作用及机制

目的：探讨miR-148a在5-aza诱导人骨髓间充质（hMSCs）成心肌样分化中的表达及miR-148a对hMSCs体外成心肌样分化的生物学作用。方法：免疫荧光检测5-aza诱导hMSCs分化后心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平;qRT-PCR和Western blot分别检测miR-148a和DNMT1在hMSCs成肌样分化中的表达水平。利用Lipofectamine TM 2000将miR-148a mimics和miR-148a inhibitor分别瞬时转染hMSCs,Western blot检测心肌细胞特异性标志物α-MHC的蛋白表达水平。利用生物信息学技术预测miR-148a的靶基因结合位点利用双荧光素酶报告基因系统鉴定其对靶基因3'UTR的结合序列。通过DNMT1 shRNA和miR-148a inhibitors共转到hMSCs中,研究miR-148a在hMSCs成心肌样分化中的调控作用。结果：hMSCs经5-aza诱导分化后,心肌细胞特性标志物α-MHC蛋白水平明显上调。miR-148a在hBMSCs成肌样分化中显著性增加（P<0.01）,DNMT1表达水平显著降低。过表达miR-148a能提高hBMSC中心肌细胞特异性标志物α-MHC表达水平,而抑制miR-148a则能降低其水平（P<0.01）。DNMT1沉默可以阻断miR-148a对hMSCs的诱导成肌样分化作用。结论：miR-148a在hMCCs成肌样分化中表达上调,通过靶定和调控DNMT1基因的表达,并对hMSCs心肌向分化具有正向调控作用。     

鸡miR-19a、miR-19b通过靶向抑制LIN9促进前脂肪细胞增殖

miR-17-92基因簇编码包括miR-19a、miR-19b在内的至少6个miRNA,在鸡细胞的增殖、分化、凋亡及发育等多种生物学过程中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚。生物信息学分析显示,细胞周期调控子LIN9是 miR-17-92 基因簇成员miR-19a和miR-19b的潜在靶点。为验证这一预测,构建含野生型LIN9 3′-UTR荧光素酶报告基因载体（psi-CHECK2-LIN9-3′-UTR-WT）及突变型报告基因载体（psi-CHECK2-LIN9-3′-UTR-MUT）,开展靶标LIN9的鉴定。复合转染结合报告基因酶活性测定结果表明,过表达miR-19a和miR-19b能显著抑制含野生型LIN9 3′-UTR的报告基因表达,而过表达miR-19a和miR-19b抑制剂显著提高野生型LIN9 3′-UTR报告基因的表达。实时定量PCR（RT-qPCR）证明,miR-19a和miR-19b 抑制剂对内源性LIN9 mRNA的表达没有影响,提示miR-19a和miR-19b可能不是通过降解mRNA调控LIN9表达。转染结合CCK-8细胞增殖分析显示,在鸡前脂肪细胞过表达LIN9 明显抑制细胞增殖。与此相一致的是,细胞增殖标志分子CyclinD1、c-Myc、PCNA、Ki67 的mRNA表达量明显降低。本研究证实,LIN9是miR-17-92 基因簇成员miR-19a和miR-19b的靶标,同时证实,LIN9抑制鸡前脂肪细胞的增殖。是否miR-17-92基因簇编码的其它mi-RNA成员也以LIN9为靶标尚不得而知,我室正在研究中。     

miR-143-3p促进C2C12成肌细胞分化

MicroRNAs (miRNAs) 是一类小非编码RNA,近年研究发现其在骨骼肌发育调控中发挥重要作用.为探明miR-143-3p在C2C12成肌细胞分化中的调控作用,采用 real-time PCR 检测了miR-143-3p在小鼠各组织及C2C12成肌细胞分化过程中的表达;使用miR-143-3p 的模拟物和特异性抑制剂分别处理细胞,采用 real-time PCR 和 Western印迹分别检测成肌因子 MyoG和成肌标志基因 MyHC mRNA和蛋白水平的变化;用免疫荧光染色的方法观察肌管的形成.结果显示,miR-143-3p在小鼠各组织中均有表达,并且随着细胞分化表达量逐渐增加;C2C12成肌细胞过表达 miR-143-3p,与对照组相比,成肌调控因子MyoG和成肌标志基因MyHC 的mRNA和蛋白表达均显著升高,肌管数量明显增多;抑制剂处理结果显示,细胞分化被显著抑制.检测miR-143-3p对MyHC各亚型表达的影响发现,miR-143-3p表达的变化并不直接影响MyHC各亚型的表达.以上结果说明, miR-143-3p在骨骼肌和成肌细胞中均有表达,能够促进C2C12成肌细胞分化,但并不直接调控MyHCs的表达.     

家蚕miR-301对化学感受蛋白基因csp9表达的调控

【目的】探索家蚕Bombyx mori miRNAs对化学感受蛋白基因表达的调控作用,以进一步研究miRNAs及其靶基因在昆虫化学识别中的作用。【方法】利用生物信息学方法预测和筛选可能作用于家蚕化学感受蛋白CSPs基因家族成员的miRNAs;实时荧光定量PCR分析预测获得的候选miR-301和其作用的靶基因在家蚕成虫不同组织中的表达变化;构建miR-301预测靶基因3′-UTR的双荧光素酶报告载体,与合成的miR-301 mimics或阴性对照转染人胚肾细胞HEK293,通过双荧光素酶报告基因检测系统中荧光素酶活性变化检测miR-301对其靶基因表达的调控作用。【结果】生物信息学分析结果发现,家蚕化学感受蛋白基因csp9是miR-301的预测靶基因,二者的结合位点位于csp9的3′-UTR区。实时荧光定量PCR检测结果表明,miR-301在交配后家蚕雌雄成虫触角和雄成虫头部都显著上调表达,靶基因csp9在对应组织中表达则显著下调。二者共转染HEK293细胞后,双荧光素酶检测结果表明,miR-301可以通过与csp9 3′-UTR的互作,显著抑制上游荧光素酶报告基因的表达。【结论】家蚕化学感受蛋白基因csp9是miR-301的靶基因,miR-301通过与靶基因3′-UTR的结合,在翻译水平上抑制csp9的表达。     

过表达miR-103促进猪前体脂肪细胞分化

为阐明miR-103在猪前体脂肪细胞分化过程中的调控作用,采用Real-time PCR检测猪前体脂肪细胞成脂分化过程中的miR-103表达谱,明确了其在分化过程中的表达趋势;使用miR-103的腺病毒超表达载体感染猪原代脂肪细胞,随后采用Real-time PCR和Western blotting分别检测成脂标记基因PPARγ、aP2的mRNA和蛋白表达量变化;油红O染色观察腺病毒miR-103侵染的前体脂肪细胞诱导分化第8天的成脂情况。结果显示,miR-103的表达量随着脂肪细胞分化而增加,在miR-103超表达的猪原代脂肪细胞的诱导分化过程中,成脂标记基因PPARγ、aP2的表达量与对照相比显著升高,分化第8天观察到明显的脂滴。说明miR-103能够促进猪前体脂肪细胞分化。     

miR-375 在AGEs介导糖尿病血管损伤细胞中的生物学功能

目的：探讨miR-375 在血管损伤细胞中的表达及生物学功能。方法：利用基因克隆技术构建miR-375表达载体;然后将 miR-375 表达质粒转染至血管损伤细胞中,同时分别设立Huvec12对照组,血管损伤细胞组,血管损伤抑制组,Huvec12 转染 miR-375 组。24h 后收集细胞,在mRNA 和蛋白水平检测Mtpn、NFγB、profilin1、sICAM1 的表达,经荧光染色观察细胞F-actin 的 变化,再用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：血管损伤细胞中过表达miR-375后,在mRNA和蛋白水平靶基因Mtpn 下降,NFγB 的表达活性下降,使糖尿病血管病变的标志profilin1 下调;F-actin 表达恢复;细胞粘附因子（sICAM1）表达下降,细胞凋亡减少。 结论：初步证明miR-375 可以抑制AGEs 介导的糖尿病血管细胞损伤的发生,可能成为糖尿病血管损伤并发症基因治疗的靶点。     

miR-138-5p靶向缺氧诱导因子1α对胰腺癌PANC-1细胞生长和转移的调节作用

目的探索miR-138-5p对胰腺癌细胞PANC-1生长、转移的影响及其相关机制。方法应用荧光实时定量PCR (real-time quantitative PCR, RT-PCR)检测miR-138-5p及其缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha, HIF-1α)在PANC-1细胞中的表达。应用荧光素酶报告检测验证miR-138-5p与HIF-1α之间的生物学关系。通过体外试验研究miR-138-5p、HIF-1α在PANC-1细胞中的生物学功能,Western blot检测蛋白表达情况;CCK-8检测PANC-1细胞增殖能力;Transwell试验检测PANC-1细胞侵袭能力;划痕试验检测PANC-1细胞迁移能力。结果 miR-138-5p表达明显下调HIF-1α表达水平(P<0.01),生物信息学预测和荧光素酶报告试验证明miR-138-5p通过直接结合HIF-1α 3′-未翻译区域(3′-UTR)抑制HIF-1α。在PANC-1细胞中,miR-138-5p过表达可抑制HIF-1α表达及细胞增殖、侵袭、迁移,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论 miR-138-5p结合HIF-1α 3′-UTR的沉默HIF-1α;miR-138-5p通过打靶HIF-1α而抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖和转移。HIF-1α可能是胰腺癌的治疗靶点。     

miRNA-1和miRNA-133过表达对L6细胞增殖与分化的影响

目的观察大鼠微小RNA-1（miR-1）、微小RNA-133（miR-133）过表达对L6成肌细胞增殖分化的影响。方法分别构建miR-1、miR-133的重组慢病毒载体,并进行测序鉴定,稳定转染L6细胞后,用RT-PCR Taqman探针的方法检测miR-1、miR-133的表达水平;细胞计数实验（CCK-8试剂盒）评价miR-1、miR-133过表达后对L6细胞增殖的影响。诱导稳定转染后L6成肌细胞进行分化,观察miR-1、miR-133过表达后对L6细胞分化的影响。以Western blot法检测miR-1、miR-133过表达后,α肌动蛋白（skeletalα-actin）表达水平的变化。采用Kruskal-Wallis H检验、重复测量和单因素方差分析进行比较。结果miR-1慢病毒载体经酶切和测序鉴定序列准确,转染48 h后L6细胞miR-1组（4.292±0.50）比control组（0.231±0.86）、miR-133组（0.205±0.48）比control组（3.564±0.45）表达均显著上调（P〈0.001）;细胞计数和细胞分化实验显示,培养120 h后,过表达miR-1的L6细胞α肌动蛋白（skeletalα-actin）比对照组（0.415±0.02）表达显著升（0.676±0.02,F=222.144,P〈0.001）,分化明显加快,但增殖无明显变化;而过表达miR-133的L6细胞增殖明显加快,α肌动蛋白表达呈下降趋势（0.363±0.02,F=2385.643,P〈0.001）,分化受到抑制。结论 miR-1、miR-133慢病毒表达载体稳定转染L6成肌细胞后高效表达miR-1和miR-133,miR-1可促进L6细胞分化,miR-133能促进L6细胞增殖但抑制其分化。     

miR-1204表达对非小细胞肺癌细胞增殖凋亡、上皮间质转化和MAPKs信号通路的影响

摘要 目的：探究微小RNA-1204（miR-1204）表达对非小细胞肺癌细胞增殖凋亡、上皮间质转化（EMT）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的影响。方法：将人非小细胞肺癌细胞A549随机分为miR-1204组（转染miR-1204mimic质粒）、NC组（转染空载质粒）和对照组（仅加转染试剂）。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖情况,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测细胞E-钙黏蛋白（E-cad）、N-钙黏蛋白（N-cad）和波形蛋白（Vim）mRNA的表达水平。采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹（WB）法检测细胞p-P38、P38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK mRNA和蛋白的表达水平。结果：培养12、24、48 h,miR-1204组细胞增殖抑制率均高于对照组和NC组同期（P＜0.05）,对照组与NC组同期的细胞增殖抑制率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。但三组细胞随着培养时间延长,细胞增殖抑制率均增加,两两时间点组内比较均有差异（P＜0.05）。miR-1204组细胞凋亡率高于对照组和NC组（P＜0.05）。miR-1204组E-cad mRNA的表达水平高于对照组和NC组（P＜0.05）,N-cad、Vim mRNA的表达水平低于对照组和NC组（P＜0.05）。miR-1204组p-P38、p-ERK、p-JNK mRNA和蛋白的表达水平均低于对照组和NC组（P＜0.05）。结论：上调miR-1204的表达可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,促进其凋亡,还可以抑制其EMT,该作用可能是通过抑制MAPKs信号通路实现的。     

miR-126报告基因载体的构建及其功能鉴定

目的:根据miR-126的预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒,并进行功能鉴定。方法:利用sanger数据库提供的miR-126靶序列设计引物,PCR扩增目的微小RNA(microRNAs,miRNAs)靶基因3'非编码区(three-prime untranslated regions,3'UTRs)序列,PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的pGL3-control载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,进行阳性克隆鉴定。同样,将候选靶基因3'UTRs突变,突变型3'UTR克隆入pGL3-control报告载体,构建野生型和突变型的报告基因重组质粒。将野生型和突变型的报告基因载体分别和化学合成的microRNA以及内参质粒共转染293TN细胞,进行双荧光素酶检测。结果:成功构建miR-126报告基因野生型和突变型重组质粒pGL3-VEGF-A-3'UTR和pGL3-VEGF-A-3'UTR,质粒测序及酶切结果完全正确。瞬时转染实验显示,过表达miR-126能直接抑制VEGF-A-3'UTRs报告基因活性。结论:miR-126对VEGF-A具有靶向调节功能。     

MiR-143 enhances adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells through targeting the coding region of mouse pleiotrophin

Adipogenic differentiation of preadipocytes is a complex process regulated by various factors including miRNAs and cytokines. MiR-143 is a well known miRNA that enhances adipogenesis. Pleiotrophin (PTN), a heparin-binding growth factor, plays a negative role in adipogenesis. In this investigation, we demonstrate that PTN is a target gene of miR-143 during adipogenic differentiation in 3T3-L1 preadipocytes. MiR-143 down regulates PTN expression through interaction with a target site of miR-143 in the coding region of mouse PTN. The rare codons upstream of the target site regulate miR143-induced translational knockdown of PTN, which provides more insight into the mechanism of adipogenic differentiation.     

MiR-143 is not essential for adipose development as revealed by in vivo antisense targeting

MiR-143 plays an important role in promoting the adipogenic differentiation of pre-adipocytes. Here, we report that systematic silencing of miR-143 in mice by using a locked-nucleic-acid-modified oligonucleotide (LNA-antimiR) did not lead to any obvious abnormalities in the adipose tissue differentiation. Furthermore, there were no significant differences in the expression level of several adipogenic marker genes, such as PPARγ and C/EBPα, in these animals compared with the controls. Therefore, we hypothesize that miR-143 may function as a fine tuning molecule rather than as a switch in the adipogenic regulatory network in mice. In addition, the proposed miR-143 target, ERK5, which was previously identified in human preadipocytes, was not effectively inhibited by miR-143 either in the murine preadipocyte cell line, 3T3-L1, or in primary mouse adipose tissue. However, we did fibroblast growth factor 7 (Fgf7) was identified as a target of miR-143 in murine adipogenesis.     

MicroRNA-338-3p promotes differentiation of mDPC6T into odontoblast-like cells by targeting Runx2

Odontoblasts are terminally differentiated cells that play a vital role in dentinogenesis. The differentiation of odontoblasts is regulated by a variety of genetic and epigenetic mechanisms. Our previous microRNA microarray studies verified that miR-338-3p was up-regulated during odontoblast differentiation. The purpose of this study was to determine the function of miR-338-3p during odontoblast differentiation. The upregulation of miR-338-3p expression during odontoblast differentiation was validated by qRT-PCR. Odontoblast differentiation was enhanced after over-expression of miR-338-3p, while a loss of function approach using a miR-338-3p inhibitor impaired odontoblast differentiation. Bioinformatic analysis identified Runx2 as a potential target of miR-338-3p. Overexpression of miR-338-3p caused a decreased in the expression of Runx2 at both mRNA and protein levels, while Runx2 expression increased after treatment with miR-338-3p inhibitors. Furthermore, the activity of a luciferase reporter plasmid containing the 3′-UTR of Runx2 was significantly suppressed by ectopic expression of miR-338-3p. These results suggested that miR-338-3p promotes odontoblast differentiation through targeting Runx2.