一条大鼠睾丸新基因的生物信息学分析及真核表达

目的:探讨大鼠睾丸组织一条新基因的生物信息学特征和真核表达。方法:构建pEGFP-N1载体的融合质粒进行真核表达,利用生物信息学手段分析基因和蛋白功能。结果:生物信息学分析表明RSA14-44的编码区序列与人类及鼠源RAS同源基因家族核酸序列达到85%以上的同源性;RSA14-44蛋白没有典型的跨膜结构域,也没有典型的N末端信号肽;与人类RhoA蛋白序列达到了89%的同源且具有Rho家族成员的GAAX盒和p-loop结构的基序特征;RSA14-44蛋白大部分氨基酸序列与Rho家族7个已知结构域高度同源;RSA14-44基因真核表达定位于细胞质。结论:RSA14-44基因真核表达定位于CHO-K1细胞质,;编码蛋白质与Rho家族同源性高,为进一步研究其生物学功能提供参考。     

真核基因的快速克隆及表达

以细胞间隙连接蛋白基因Cx26作为目的基因,通过T-A载体介导,构建真核表达重组载体pcDNA3.1( ) /Cx26,重组表达载体转染人鼻咽癌细胞株HNE1,表达Cx26间隙连接蛋白。     

牛METTL3真核表达载体的构建及生物信息学分析

[目的]对牛甲基转移酶METTL3基因进行真核表达并对其蛋白进行生物信息学分析.[方法]以MDBK细胞为模板,RT-PCR扩增牛METTL3基因片段,构建pcDNA3.0-METTL3载体并转染至293T细胞后,进行Western Blotting验证,通过生物信息学在线工具分析METTL3蛋白.[结果]PCR、双酶切...     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

小鼠Uncv基因克隆及真核表达

目的 克隆小鼠的Uncv基因并在真核细胞表达.方法 采用RT-PCR方法扩增小鼠皮肤组织中Uncv基因编码区,以真核表达质粒pcDNA 3.1-Flag为载体,构建Uncv真核表达质粒,将重组载体转染Hela细胞并用Western blot法检测基因表达.结果 构建Uncv基因真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Unev,重组质粒在Hela细胞中有效表达约95×103的融合蛋白.结论 成功构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag/Uncv,并且在真核细胞中有效表达,为研究Uncv基因生物学功能奠定基础.     

Bt新型基因sip的克隆、表达和生物信息学分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白对农业害虫有特异的杀虫活性,对环境无污染、对人畜无害,成为目前为止研究和应用最为广泛的生物杀虫剂.其中内毒素(insecticidal crystal proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)研究范围广、技术成熟,而分泌期杀虫蛋白(Secreted insecticidal protein,Sip)相关报道较少.为进一步发掘我国苏云金芽胞杆菌的菌株资源和新型基因资源,从不同生态环境中分离出400株Bt野生菌株进行sip基因的克隆鉴定,其中Bt野生菌株QZL26扩增得到1 038 bp的碱基的序列,编码345个氨基酸,与Sip1A蛋白氨基酸序列同源性为91.83％.测序结果提交GenBank注册,登录号为JQ965994.     

水稻硒结合蛋白基因OsSBP的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻硒结合蛋白(selenium-binding protein, SBP)基因的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa Japonica)为材料,采用同源克隆法获得Os SBP,并对其进行组织特异表达及生物信息学分析。结果表明,Os SBP基因cDNA序列为1 623 bp,包括长度为1 449 bp的CDS,碱基组成为A 23.3%、T 25.1%、G 28.9%、C 22.6%,编码482个氨基酸残基组成的蛋白质。Os SBP蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位Os SBP主要分布在细胞质中,推测可能在运载结合、辅助因子中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在24个丝氨酸磷酸化,11个苏氨酸磷酸化位点和10个酪氨酸磷酸化位点以及6个糖基化位点。启动子元件分析表明,其含有与热胁迫、干旱胁迫、光反应、细胞防御、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信号传导相关元件。进化分析结果表明,克隆的Os SBP氨基酸序列与短柄草、高粱的同源关系较近,具有较高的保守性,与莱茵衣藻的同源关系较远。RT-PCR分析结果表明,Os SBP基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和根,穗中表达量最低,且该基因的表达受Cd,盐和热的诱导,以及PEG和Cold的抑制。该基因的成功克隆及分析为进一步研究Os SBP在水稻抗逆中的作用奠定了重要的基础。     

番茄COBRA基因克隆、表达模式及生物信息学分析

COBRA作为一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇(GP-I)锚定蛋白,影响植物细胞壁中纤维素含量及细胞的定向伸长。目前已有多个拟南芥、玉米及水稻的COBRA基因的突变体被研究。而有关番茄COBRA基因克隆的研究尚未见报道。本研究利用RT-PCR技术克隆了一个假定编码番茄COBRA蛋白的SlCOBRA基因,并在GenBank注册(JN398667)。序列测定和分析表明,该序列由6个外显子组成,编码444个氨基酸残基;氨基酸序列中存在COBRA蛋白的CCVS保守基序,N端的跨膜信号肽及C-末端的疏水性尾部和GPI锚定ω-位点。系统进化分析表明番茄SlCOBRA与拟南芥AtCOB具有80%氨基酸序列同源性,聚在一个分支上。Real-time PCR分析番茄各个组织中COBRA基因的表达结果表明番茄COBRA为组成型表达,在营养器官(根、茎、叶)中的表达量高于花和果实,尤其在成熟的果实中(从转色期到红熟期)表达量明显减少。     

多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人存活蛋白（survivin）-2B主要T细胞表位区域、人和猴绒毛膜促性腺激素β链的核心片段CTP37区域融合基因的真核表达质粒,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法：通过基因合成和搭桥PCR技术构建含有Survivin2B主要T细胞表位区域、人和猴CTP37区域基因的融合基因2PAG,将其插入含有人IgK链前导信号肽（sig）、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号肽融合基因序列的细胞膜锚定修饰真核表达载体pCI—Fc—GPI中,继而又将酶切后的sig2PAG-FC-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点（IRES）基因且可以共表达人GM-CSF和B7．1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM／B7中;将构建的重组质粒pVAX1-sig-2PAG-FC-GPI-GM／B7（简称pVAX1-2PFcGB）转染293T细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果：2PAG融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX-IRES-GM／B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组质粒pVAX1-2PFcGB在293T细胞中得到很好的表达。结论：成功构建了重组质粒pVAX1-2PFcGB,且在293T细胞中可以有效表达,为对该基因疫苗的后续功能研究奠定了基础。     

大鼠gremlin1真核表达载体的构建及表达

构建大鼠gremlin1的真核表达载体pcDNA-gremlin,并观察其在真核细胞中的表达。从大鼠脑组织中提取mR-NA通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及巢式聚合酶链反应(nest-PCR)获得编码gremlin1的cDNA,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中;经酶切和测序鉴定构建正确,应用脂质体法转染HSC-T6细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内grem-lin1的表达。结果显示,构建了大鼠gremlin1的真核表达载体,转染HSC-T6细胞培养48 h后,收集并裂解转染细胞,蛋白免疫印迹法检测到转染HSC-T6细胞内gremlin1的表达显著增高。成功构建了真核表达载体pcDNA-gremlin,为研究gremlin在大鼠肝纤维化发生发展过程中的作用及作用机制奠定了基础。     

牦牛OB基因的克隆及原核表达

肥胖基因(obese gene,OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能。通过牦牛脂肪组织总RNA的提取,利用RT-PCR克隆出牦牛OB基因的成熟肽cDNA,构建OB基因的原核表达载体OB-pET32a(+),在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达,通过SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明,克隆的OB基因成熟肽片段为456 bp包含EcoR I和BamH I两个酶切位点,与普通牛、瘤牛该基因的相似性达98.6%。原核表达产物为包涵体形态,大小为31 kD,符合预期结果,为OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。     

青杄中sPPa1的cDNA序列克隆及其生物信息学分析

以青杄(Picea wilsonii)均一化cDNA文库为模板,通过RACE方法克隆得到青杄PPa1基因cDNA全长,对该cDNA序列、核苷酸序列的相似性、理化性质、疏水性、二级结构、三级结构及是否跨膜进行了分析预测;进行了多序列比对并构建了系统树,同时对PPa1在青杄各组织中的表达量进行了检测.结果表明:青杄PPa1基因共由216个氨基酸组成,分子量为24.55 kD,理论PI为5.83,属可溶性蛋白;二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲和β-折叠构成;PPa1在青杄花粉中表达量最高.研究为进一步研究青杄PPa1的功能奠定了基础.     

FASN基因的原核表达及生物信息学分析

脂肪酸合成酶(FASN)在生物体内起着重要的作用,主要参与恶性肿瘤的数量调控。本研究旨在构建pET28a-FASN原核表达载体,并表达重组His-FASN蛋白,对该基因进行结构与功能的生物信息学分析。设计FASN基因特异性引物,通过PCR扩增获得的目的基因与原核表达载体pET28a连接,经IPTG诱导表达His-FASN蛋白。获得基因片段大小为1 320 bp,编码440个氨基酸;成功构建至pET28a原核表达载体,通过优化表达,确定在温度为35℃、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间为6 h的条件下融合蛋白表达量较高,获得蛋白大小约为53 kD;生物信息学分析结果表明FASN基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,不存在信号肽及跨膜区,可成为蛋白激酶磷酸化位点有12个Ser、5个Thr、3个Tyr。此外,从蛋白相互作用网络中发现,相互作用的蛋白包括主要酰基辅酶A合成酶长链家族成员及乙酰辅酶A羧化酶家族成员,为开发抑制剂药物提供了理论依据。     

虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)Vasa基因的克隆与表达

Vasa基因是DEAD-box家族成员中的一种ATP依赖的RNA解旋酶编码基因,在生殖系分化过程中发挥重要作用。采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从虾夷马粪海胆精巢中克隆得到Vasa基因3′端cDNA序列。该3′末端cDNA长1057bp,与太平洋牡蛎、紫球海胆、非洲爪蟾、小鼠及虹鳟经同源进行比对,其中与紫球海胆的同源率最高达到95%,并确定其为DEAD-box家族的Vasa亚家族成员。利用实时定量RT-PCR检测Vasa mRNA在虾夷马粪海胆组织和胚胎发育期的表达情况,研究结果表明Vasa基因在生殖腺表达量最高,雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性高于雌性,差异显著(P<0.05),在肠、体腔液、肌肉、围口膜、管足中表达量低,其中体腔液表达量最低。胚胎发育期检测发现Vasa基因在16细胞期时表达量最高,16细胞期后表达量呈下降趋势,囊胚期表达量最低。试验结果为虾夷马粪海胆生殖系统起源、分化研究提供科学依据。对于虾夷马粪海胆生殖系分化途径来讲,Vasa可作为一种有利的研究工具,追溯其生殖系的起源和分化。     

血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达

构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达重组体 ,并进行初步表达。从人胎盘组织中提取总RNA ,经反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增出arresten基因 ;采用T A克隆法 ,将arresten基因克隆入pGEM T载体中 ,经DNA测序确认后 ,构建原核表达重组体pRSET Arr,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,用IPTG诱导表达。所获得的arresten基因经测序正确 ,并表达重组蛋白 ,经SDS PAGE分析 ,相对分子量为 2 6ku。构建的原核表达重组体pRSET Arr能高效表达重组arresten蛋白。     

牡丹ACC合成酶ACS1基因的克隆与原核表达

从牡丹‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘ Luo Yang Hong’)花瓣中提取总RNA,根据GenBank上牡丹ACC合成酶基因PsACS的序列设计引物,通过RT-PCR获得牡丹PsACS1基因序列,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.将PsACS1基因cDNA片段与pET28a(+)构建原核表达载体pET-ACS1,转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3).0.4 mmol/LIPTG诱导3h后,在预期的蛋白分子量55 kD处出现1条表达加强的蛋白条带.为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础.     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶基因的克隆及生物信息学分析

乙酰木聚糖酯酶可以水解乙酰化木聚糖中的O-乙酰取代基团,消除该基团对木聚糖酶水解的空间阻碍作用,增强木聚糖酶对木聚糖的亲和力和降解能力。以白色链霉菌基因组为模板,利用简并PCR和TAIL-PCR扩增获得长约741 bp阅读框片段,编码247个氨基酸。生物信息学分析表明,该多肽片段具有AXE1家族蛋白保守区域;与已知的乙酰木聚糖酯酶蛋白C端区相比,相似性较高,二级和三级结构空间排布特点极为相似;初步判定该多肽片段为白色链霉菌乙酰木聚糖酯酶的C端区域。     

青杄中sPPa1的cDNA序列克隆及其生物信息学分析

以青杄(Picea wilsonii)均一化cDNA文库为模板,通过RACE方法克隆得到青杄PPa1基因cDNA全长,对该cDNA序列、核苷酸序列的相似性、理化性质、疏水性、二级结构、三级结构及是否跨膜进行了分析预测;进行了多序列比对并构建了系统树,同时对PPa1在青杄各组织中的表达量进行了检测。结果表明:青杄PPa1基因共由216个氨基酸组成,分子量为24.55 kD,理论PI为5.83,属可溶性蛋白;二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲和β-折叠构成;PPa1在青杄花粉中表达量最高。研究为进一步研究青杄PPa1的功能奠定了基础。