DLC-1 基因在MCF-7 人乳腺癌细胞系中低表达的机制探究

目的:探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的机制。方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)检测人乳腺癌细胞MCF-7的DLC-1基因甲基化状态,不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)处理人乳腺癌细胞MCF-7,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中DLC-1基因mRNA表达水平变化。结果:DLC-1基因启动子区CpG岛呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,DLC-1基因启动子区呈去甲基化状态,并且其mRNA恢复表达。结论:抑癌基因DLC-1 CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一,5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。     

DLC-1基因与乳腺癌

肝癌缺失基因1（DLC-1）是一种肿瘤阻抑基因,位于人类染色体8p21.3-p22,在多种肿瘤中呈低表达或缺失,其与乳腺癌的发生、发展及侵袭转移关系密切。本文就DLC-1基因的结构及生物学功能、在乳腺癌中失活的机制和在乳腺癌中的表达及其意义作一综述。     

乳腺癌特异性基因1(BCSG1)异常表达的调控机制

从乳腺癌cDNA文库中分离出的乳腺癌特异性基因1(BCSG1, breast cancer-specific gene 1) 又称Synuclein γ, 其表达蛋白广泛分布在神经系统的神经元突触前末稍. 除神经系统外, 正常乳腺组织或良性病变中BCSG1几乎不表达, 而多数浸润性乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中表达异常增高. BCSG1的异常表达与肿瘤细胞的生长、浸润及转移相关. 为了解BCSG1的转录调控机制及转录因子对调控的影响, 用含启动子的BCSG1片段构建了不同长度的3¢端缺失片段、删除Sp1片段以及突变转录激活蛋白1(AP1, activator protein)位点的BCSG1启动子报告质粒, 并选用乳腺癌细胞系进行瞬时转染, 分析BCSG1启动子活性变化. 研究发现, BCSG1启动子5¢端区序列可决定BCSG1的基础转录活性, 并受Sp1位点调控; 在BCSG1蛋白阴性的乳腺癌细胞中, pGL3-1553的活性显著降低; 在HepG2肝癌细胞中, pGL3-1759的活性显著降低; 内含子1中AP1位点突变或缺失使启动子转录活性明显降低; c-jun和c-fos, 及cAMP效应器结合蛋白(CREB, cyclin AMP-responsive element binding)可以显著增强BCSG1启动子的活性. 这些结果表明, BCSG1的异常表达可能受多种因素影响, 5¢端区序列及Sp1位点决定BCSG1启动子的基础活性; 外显子1中含有可能影响BCSG1异常表达的关键序列; 决定细胞特异性表达的序列可能存在于内含子1中; 内含子中AP1结合位点可以调控BCSG1启动子的活性.     

乳腺癌相关基因的DNA甲基化

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。DNA甲基化作为哺乳动物细胞基因组修饰和表达调控的表观遗传学方式,在肿瘤的发生发展过程中总体水平降低,但同时又伴随某些基因的高甲基化。在乳腺癌中,多种关键基因的表达缺失都与其CpG岛高甲基化有关。     

shRNA下调MTDH基因抑制人乳腺癌MCF-7细胞HIF-1α及VEGF表达

目的：探讨转移粘附基因（metadherin,MTDH）的表达对人乳腺癌细胞中肿瘤血管生成相关分子标志物缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：将针对MTDH基因的干扰质粒MTDH-shRNA转染乳腺癌MCF-7细胞,RT-PCR及Western blot验证其对MTDH基因的沉默效果;应用Western blot检测转染前后MCF-7细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）在蛋白水平上的表达变化;MTT实验检测下调MTDH对MCF-7细胞增殖情况的影响。结果：MCF-7细胞转染48小时后,MTDH-shRNA转染组和MTDH-shRNA-neg转染组转染效率约70%。MTDH-shRNA转染组中MTDH在mRNA及蛋白水平上表达明显下调,此外HIF-1α及VEGF蛋白表达明显降低,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。MTDH-shRNA转染组MCF-7细胞增殖明显受到抑制,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：在乳腺癌MCF-7细胞中下调MTDH基因可以抑制HIF-1α、VEGF表达及细胞增殖,提示MTDH基因可能对乳腺癌肿瘤血管生成有促进作用。     

沉默Bmi-1基因表达对MCF-7细胞阿霉素敏感性的影响

目的研究Bmi-1对MCF-7细胞阿霉素敏感性的影响及机制。方法阿霉素处理MCF-7／Bmilsi、MCF-7／GFPsi和MCF一7细胞株,M1Tr法检测阿霉素的IC50;DAPI检测阿霉素处理后细胞的凋亡,计算凋亡指数（apoptosisindex,AI）;Western印迹检测相关蛋白P53,phospho—Akt（Ser473）（pAkt）,totle—Akt（tAkt）,Bcl-2,Bax的表达。结果阿霉素处理72h的MCF-7／Bmi．1si组生长抑制率明显高于MCF-7和MCF-7／GFPsi组,MCF-7／Bmilsi组的IC50为（0．15±0．02）μg／ml,而MCF-7组和MCF-7／GFPsi组的IC50分别为（0．87±0．06）μg/ml和（0．81±0．02）μg/ml（P〈0．05）。阿霉素处理48h后用DAPI检测凋亡发现,MCF-7／Bmi．lsi＋doxorubiein组可见大量凋亡细胞,而MCF-7＋doxorubicin和MCF-7／GFPsi＋doxo—rubicin组出现较少的凋亡细胞,MCF-7／Bmi-1si＋doxorubicin组凋亡指数明显高于对照组（P〈0．05）。进一步研究发现：MCF-7／Bmi．1si＋doxorubicin组与MCF-7＋doxorubiein及MCF-7／GFPsi＋doxorubiein组相比,P53表达量增加,tAkt表达未发生改变,而pAkt的表达明显减少,另外,Bcl-2表达量减少而Bax表达量增加,差异具有显著性（P〈0．05）。结论沉默Bmi—l基因表达能增加MCF-7细胞对阿霉素的敏感性,增加阿霉素引起的凋亡。     

BRCA1基因与乳腺癌

乳腺癌易感基因1(BRCA1)是具有遗传倾向的乳腺癌和卵巢癌的易感基因,且是一种抑癌基因.BRCA1基因的突变与家族性乳腺癌及它在细胞周期的调节,DNA损伤修复,基因的转录调控和诱导细胞凋亡方面起着重要作用.BRCA1基因的突变与家族性乳腺癌及卵巢癌的发生密切相关,对BRCA1分子功能的研究,将有利于阐明肿瘤发生的机理关.BRCA1的启动子甲基化与散发性乳腺癌有关.本文拟对BRCA1的结构,功能以及它的甲基化,突变,杂合性丢失对乳腺癌的影响作一综述.     

甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC-1基因表达的影响

肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)在多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调,这种异常表达主要与由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)参与的启动子区异常甲基化有关。RT-PCR结果显示DLC-1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和干扰DNMTs的5-8F细胞中的表达水平较未干扰的鼻咽癌细胞明显升高。甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSPCR)结果则表明DLC-1启动子区在表达下调或缺失的鼻咽癌细胞中均存在异常高甲基化,而干扰DNMTs后5-8F细胞中DLC-1启动子区甲基化状态被逆转,其中特异性干扰DNMT1后效果略为显著,提示DNA甲基转移酶活性对于鼻咽癌中DLC-1启动子区甲基化水平具有重要的调控作用,而DNMT1的调控作用更为突出。     

KAI1基因转染人乳腺癌细胞系的建立及初步研究

目的:通过将外源性KAI1基因转染入高转移性人乳腺癌细胞株,为乳腺癌基因治疗的实验室研究提供靶细胞,并初步探讨该基因对乳腺癌细胞增殖能力及细胞周期的影响。方法:采用脂质体法将pCMV-KAI1质粒转染入低表达KAIl基因的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,经G418筛选后获得抗性克隆,利用RT-PCR、Western blot分析目的基因及其蛋白的表达情况,并利用MTT法和平板克隆形成实验初步探讨该基因对乳腺癌细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测细胞生长周期的变化。结果:稳定转染KAI1基因的细胞株中有外源性目的基因和相应蛋白的高表达;MTT法示细胞增殖力下降,转染KAI1基因的集落形成率(25.33 2.36)％较转染前(43．17 2．75)％明显降低(P<0．05),流式细胞术显示转染KAI1基因后G1／G0期细胞数量由未转染前的(36．78 0．61)％升高至(64 7．56)％,M／G2期细胞数量则由(17．88 0．76)％降至(7．63 0．60)％,差异有显著性。结论:通过脂质体转染法获得了高表达KAI1基因及其蛋白的人乳腺癌细胞株,并发现该细胞株的体外增殖能力明显下降,这可能是KAI1基因通过调节细胞周期来实现的。     

抑癌基因DLC-1的研究进展

DLC-1(肝癌缺失基因1)是近年来被发现的一种重要的抑癌基因,目前研究发现其在多种肿瘤的发生、发展过程中产生了重要的作用。随着基因技术及分子生物技术的飞速发展,关于DLC-1基因以及与之相关的上、下游靶基因,DLC-1基因的甲基化修饰及其相互作用的信号传导通路的研究将更深入、更彻底、更清楚。通过构建肿瘤动物实验模型,我们可以对人类各种肿瘤进行去甲基化药物治疗,分析实验结果,综合评估治疗指征,为临床上对肿瘤的治疗提供理论基础及实践指导。相信在不久的将来,针对DLC-1基因在肿瘤分子生物学研究有望成为多种肿瘤诊断、治疗的突破。     

抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞sw480中表达的研究

目的:初步探讨DLC-1基因在结肠癌细胞sw480中的表达改变及其可能机制;方法:采用RT-PCR和Western blot分析结肠癌细胞CaCo2、sw480的DLC-1表达情况;应用去甲基化药物5—氮杂胞苷处理DLC-1基因阴性表达的细胞株,观察用药前后该细胞DLC-1基因的表达水平、细胞周期、细胞增殖力和侵袭力的影响。结果:CaCo2细胞高表达DLC-1 mRNA,而sw480则呈现表达缺失。经去甲基化药物5—氮杂胞苷处理sw480后,DLC-1 mRNA恢复表达,比较用药前后sw480细胞增殖力下降、细胞周期被阻滞在G2期、细胞侵袭力减弱。结论:DLC-1基因可影响结肠癌细胞sw480的增殖能力和侵袭力,并使结肠癌细胞sw480细胞周期阻滞于G2期,DNA甲基化可能是导致DLC-1在sw480细胞中的失活的一个重要原因。     

DLC-1基因表达对结肠癌细胞侵袭转移能力的影响

目的:研究DLC-1基因对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法:将DLC-1 shRNA(短发夹状RNA,short hairpin RNA)序列克隆到质粒pGCsi-U6/Neo载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的DLC-1 shRNA表达质粒转入结肠癌细胞系LoVo细胞.采用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测LoVo细胞中DLC-1mRNA和蛋白表达水平的变化.Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验观察LoVo细胞侵袭迁移能力的改变.结果:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1分子.所构建质粒表达载体能有效地干扰LoVo细胞DLC-1 mRNA和蛋白质表达水平;Transwell小室人工重组基底膜侵袭转移实验结果显示,转染后LoVo细胞侵袭转移能力明显增强(p＜0.05).结论:结肠癌细胞系LoVo细胞表达DLC-1基因,应用RNAi技术可特异性降低其表达.DLC-1的表达水平与结肠癌细胞侵袭转移相关.     

人类抑癌基因beclin 1在胃癌和直结肠癌中表达下调的研究

人类抑癌基因beclin 1通过自噬作用调节细胞生长,但在胃癌和直结肠癌中其表达水平和调控机制仍不清楚．通过检测胃癌和直结肠肿瘤组织中beclin 1基因的表达水平,及DNA异常甲基化和杂合子缺失对其表达的影响,发现与癌旁组织相比,35％的胃癌标本和30％的直结肠癌标本中beclin 1基因表达显著下调．同时发现,beclin 1基因5’端存在一高密度CpG岛,在胃癌和直结肠癌中beclin 1的启动子区域和第二个内含子区域存在甲基化,而杂合子缺失仅在胃癌中发生．这些发现表明beclin 1基因的异常甲基化和杂合子缺失对其在胃癌和直结肠癌中的表达起调控作用．     

靶向下调FOXM1基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的：探讨靶向抑制FOXM1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法：利用重组真核转录载体pSilencer1．0-U6-FOXMI—shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量·聚合酶链反应（Real—timeqPCR）、蛋白免疫印迹法（Westemblot）分别检测FOXMl基因在mRNA、蛋白水平的表达变化。结果：重组载体pSileneerl．0-U6-FOXMl-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降（P〈0．05）,平板克隆形成显著减少（P〈0．05）,重组载体转染后显著抑制MDA—MB-231细胞中FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达。结论：沉默FOXMI基因对乳腺癌细胞株MDA—MB-231生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

垂体瘤转化基因1(PTTG1)的表达变化对人前列腺癌细胞LNCaP生长增殖的影响

垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)具有促进肿瘤生长和转移的作用.通过上调或下调基因表达的策略,观察PTTG1基因对人前列腺癌细胞株LNCaP细胞生长增殖的影响.利用PCR技术分离出PTTG1全长cDNA,分别正向和反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP,重组载体分别命名为正义PTTG1-S/pIRES2-EGFP(即pI-P-S)和反义PTTG1-AS/pIRES2-EGFP(即pI-P-AS),将这两种重组载体稳定转染LNCaP细胞,通过流式细胞仪和MTT法分别检测了细胞周期和细胞增殖的情况.转染正义PTTG1后处于S期和G2期的细胞明显增加,细胞生长增殖能力增强;相反,转染反义PTTG1后处于S期和G2期细胞明显减少,细胞生长增殖能力减弱(P<0.05).结果表明,PTTG1能明显改变人前列腺癌细胞株LNCaP的细胞周期和细胞生长增殖能力,它的异常表达可能参与前列腺癌细胞生长增殖过程.     

The Effects of Nucleoside Analogues on Promoter Methylation of Selected Tumor Suppressor Genes in MCF-7 and MDA-MB-231 Breast Cancer Cell Lines

The effects of 2-chloro-2′-deoxyadenosine, 9-β-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine, and 5-aza-2′-deoxycytidine on promoter methylation of the selected tumor suppressor genes (i.e., ERα, BRCA1, RARβ2, E-cadherin, PTEN, and APC) were estimated using methylation-sensitive restriction analysis. The studies were carried out in hormone-responsive, low-invasive cell line MCF-7 and hormone-insensitive, highly invasive cell line MDA-MB-231. The results demonstrate an implication of the tested adenosine analogues and 5-aza-dCyd in regulation of DNA methylation process. Moreover, the effects of nucleoside analogues on PTEN promoter methylation suggest distinct mechanism of regulation of the epigenetic DNA modification in low-invasive compared to highly invasive breast cancer cells.