结核杆菌Hsp65 与人IL-2 融合蛋白在耻垢杆菌表达

目的:构建能够分泌表达结核分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与人IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium Smegmatis,rMs)。方法:用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切含Hsp65-IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断Hsp65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中。重组质粒pDE22-hsp65-IL-2酶切鉴定正确后,电穿孔转化MS感受态,潮霉素抗性压力筛选阳性rMs。Western-blot鉴定rMs培养上清蛋白中目的蛋白的表达。结果:重组pDE22-hsp65-IL-2质粒酶切后可获得约2000 bp片段,与预期大小一致。Western-blot结果表明,rMs培养上清蛋白中有特异性反应条带,大小为78kD,与Hsp65-IL-2融合蛋白大小相一致。结论:成功构建了大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22-hsp65-IL-2,为该rMs的免疫学特性及抗结核分枝杆菌感染的保护效果研究奠定了基础。     

结核杆菌DnaA蛋白在耻垢分枝杆菌中的同源表达

目的：在耻垢分枝杆菌中表达重组结核杆菌DnaA蛋白并对表达产物进行鉴定。方法：用PCR的方法扩增结核杆菌dnaA基因并克隆至表达载体pMF406中,构建重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMF-dnaA。经双酶切及测序鉴定后,用电转化的方法将重组质粒转至耻垢分枝杆菌mc2155中。用0.02%乙酰胺诱导重组耻垢分枝杆菌,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测和鉴定。结果：重组耻垢分枝杆菌构建成功,SDS-PAGE及Western blotting结果显示该重组耻垢杆菌可以实现结核杆菌DnaA蛋白的同源高效表达。结论：结核杆菌DnaA蛋白的同源表达为结核杆菌DNA复制机制的研究奠定了基础。     

胞壁表达HSP65-IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建和鉴定

目的：获得胞壁表达结核分枝杆菌热激蛋白65（HSP65）和人白细胞介素2（IL-2）融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法：将HSP65和IL-2融合基因克隆入大肠杆菌-卡介苗（E．coli-BCG）穿梭质粒pCW,构建成重组质粒HSP65-IL-2-pCW,电穿入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选和PCR方法选取阳性克隆;用间接免疫荧光法对重组耻垢分枝杆菌进行表型鉴定;用重组耻垢分枝杆菌免疫BALB／c小鼠,检测其诱导的抗体水平。结果：筛选获得的重组耻垢分枝杆菌增殖特性与普通耻垢分枝杆菌无明显区别;与抗人的IL-2抗体和HSP65抗体均可形成免疫印迹条带;间接荧光染色后,可见细菌表面有极强的绿色荧光;重组耻垢分枝杆菌免疫BALB／c小鼠2周后,小鼠血清中HSP65抗体平均滴度为1：4000,而生理盐水组的抗体几乎为阴性。结论：结核分枝杆菌HSP65和人IL-2融合基因在耻垢分枝杆菌胞壁获得表达,有望为结核病的预防提供有效的疫苗。     

结核杆菌eis基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的:构建结核分枝杆菌eis基因的穿梭表达载体,鉴定其在重组耻垢分枝杆菌中的生物活性。方法:采用PCR技术克隆结核分枝杆菌eis基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV-eis,经酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc²155中,采用SDS-PAGE和Western blot检测eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达。结果:成功构建结核杆菌eis基因穿梭表达载体pMV-eis;生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分枝杆菌的体外生长;SDS-PAGE 和Western blot检测证实eis在耻垢分枝杆菌中可表达出相对分子量约42kDa的Eis蛋白。结论:成功构建了eis基因穿梭表达质粒pMV-eis,且该重组质粒在耻垢分枝杆菌中具有生物活性,为下一步研究表达产物Eis的功能奠定了一定基础。     

大肠杆菌-分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达

用PCR技术从Bacillus Calmetteguérin(BCG)基因组中扩增出抗原85B(Ag85B)的信号肽(SP)DNA序列,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG2100的人结核杆菌HSP70启动子下游,构建成分泌型原核穿梭表达质粒(pBCGSPHSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCGSPHSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterial smegmatis, MS)中,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS-PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中65kD蛋白占总蛋白的20%,而在重组耻垢分枝杆菌表达的65kD蛋白占菌体总蛋白的34.46%,占裂解物上清总蛋白的68.56%,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Westernblot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。     

Hsp65与IL-2融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答及保护力

目的研究Hsp65与hIL-2的融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法在大肠杆菌中诱导表达Hsp65与hIL-2的融合蛋白,通过Ni-NTA亲合柱纯化后的蛋白经鉴定后,与佐剂DDA和MPL联合免疫小鼠,连续免疫3次,每次间隔2周,最后一次免疫结束后两周,分离5只小鼠脾淋巴细胞,测定淋巴细胞增殖指数,IFN-γ和IL-2水平,以及特异性淋巴细胞杀伤功能,其余5只免疫小鼠用于MTB毒株攻击实验。结果获得融合蛋白可分别与抗Hsp65和抗hIL-2的单抗发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞被有效活化,诱导产生的-γIFN和IL-2的水平以及CTL杀伤功能均显著高于BCG和单纯Hsp65免疫组（P〈0.05）。融合蛋白免疫组可有效抵抗MTB毒株攻击,脾脏细菌数显著减少（4.36±0.48）,提供的保护力与BCG相当（4.30±0.53）。结论Hsp65与hIL-2的融合蛋白是一种有效的亚单位疫苗,可用于TB的预防。     

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建

目的 建立可表达绿色荧光蛋白的耻垢分枝杆菌,便于对耻垢分枝杆菌进行直观检测和快速定量。方法利用PCR技术从真核表达质粒pLVTH扩增获得绿色荧光蛋白的编码基因,克隆人大肠埃希菌一分枝杆菌穿梭载体pMV261,建立重组质粒pMVGFP,并经酶切鉴定证实。利用电穿孔技术将pMVGFP转化入耻垢分枝杆菌,利用卡那霉素抗性筛选重组耻垢分枝杆菌克隆,扩大培养后直接涂片,荧光显微镜镜检。结果重组质粒pMVGFP构建正确;将重组耻垢分枝杆菌在荧光显微镜下观察,证实绿色荧光蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。结论自发释放荧光的重组耻垢分枝杆菌的成功建立,为研究结核病致病机制和快速筛选化学药物等奠定了基础。     

耻垢分枝杆菌在感染与免疫研究中的应用

耻垢分枝杆菌属革兰阳性腐生菌,具有快速生长,无致病性,与结核分枝杆菌基因高度同源、细胞结构相似等特点,较多应用于分枝杆菌感染及相关免疫学研究,是一种相对理想的实验模型。同时,其在非分枝杆菌感染及其他相关免疫研究中也有拓展性的应用。本文就耻垢分枝杆菌在感染与免疫研究中的应用现状进行综述。     

结核杆菌活动期高表达基因Rv1776c的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

目的 构建表达结核分枝杆菌Rv1776c基因的重组耻垢分支杆菌,并鉴定该基因在重组耻垢分支杆菌中的活性。方法 采用PCR技术克隆结核分枝杆菌Rv1776c基因,构建大肠埃希菌‒分支杆菌穿梭表达质粒pMV-Rv1776c,通过酶切和测序鉴定其正确性,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分支杆菌mc2155中。以SDS-PAGE及Western blot检测证实Rv1776c蛋白在重组耻垢分支杆菌内的表达。结果 重组耻垢分支杆菌构建成功,生长曲线说明重组质粒不会影响耻垢分支杆菌的体外生长;SDS-PAGE及Western blot检测证实Rv1776c在耻垢分枝杆菌内表达出相对分子量约56 kD的Rv1776c蛋白。结论 成功构建了Rv1776c基因的穿梭质粒pMV-Rv1776c,且该质粒在耻垢分枝杆菌内具有生物活性,为进一步研究其表达产物的功能提供基础。     

耻垢分枝杆菌感染人脐带间充质干细胞模型的建立及其特征

【背景】结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)休眠菌形成被认为是潜伏结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)的主要原因,但目前缺乏体内和体外模型进行机制研究。新近研究表明Mtb可感染间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)并以休眠状态在细胞中长期存活。然而Mtb感染细胞模型存在周期长和生物安全要求高等问题,需要探索可用的MSC感染细胞模型用于Mtb休眠机制的研究。【目的】建立快速生长型耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis,Ms)感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord MSC, hUCMSC)的细胞模型并研究其特征。【方法】取分离好的hUCMSC,流式细胞术鉴定其表面标志性抗原;以Ms菌株感染hUCMSC,DiI标记细胞膜,荧光显微镜下观察细胞吞噬作用;平板法计数Ms胞内存活率;油红O染色观察细胞脂滴形成;鬼笔环肽荧光染色观察细胞骨架变化;实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR,RT-qPCR)检测Ms...     

结核杆菌抗原HSP65基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :为研制预防结核病疫苗 ,选取结核杆菌HSP65蛋白为免疫抗原 ,将结核分枝杆菌HSP65抗原基因在大肠杆菌中表达、纯化。方法 :将HSP65的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX5T中 ,构建成pGEX5T HSP65重组质粒。将质粒转化到E .coli.K80 2细菌 ,用IPTG诱导HSP65表达 ,然后用亲和层析的方法进行纯化 ,最后用Western blot方法确认表达蛋白的特异性。结果 :获得了pGEX5T HSP65重组子 ,HSP65蛋白在k80 2菌中获得了表达 ,表达的蛋白条带大小约 86kDa ,与预期的结果相符。表达产物经亲和层析后获得了较单一的蛋白条带 ;表达及纯化的蛋白在纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别。为进一步研究其在结核病诊断和防治中的应用打下了基础。     

OPG-HSP65重组蛋白的原核表达及其生物学活性研究

PCR扩增OPG-HSP65基因,构建原核重组表达载体pET-28a－OPG-HSP65,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白。对重组蛋白进行Western blot检测表明,重组蛋白能与抗His-Tag单克隆抗体及鼠抗人OPG单克隆抗体特异性结合。对重组蛋白进行尿素洗涤纯化,进而透析、复性。经破骨细胞生长抑制实验和抑炎实验表明,重组蛋白能减少破骨细胞生成及减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应。     

重组卡介苗HSP65抑制小鼠移植黑色素瘤的初步药效学研究

观察卡介苗来源的热休克蛋白HSP65对小鼠移植黑色素瘤的抑制作用并初步探讨可能的作用机制。通过基因工程手段获得纯化的重组HSP65蛋白,与弗氏佐剂联合给药C57BL/6J小鼠。分别设计了两组免疫方案,一组于肿瘤细胞接种前免疫3次,另一组于肿瘤细胞接种前免疫7次。结果在免疫3次的情况下,虽然也能激发较高的特异性抗HSP65抗体,但抑瘤效果不明显(抑瘤率14.2%);增加免疫次数到7次后,抑瘤率高达73.2%,效果显著。经肿瘤组织病理切片发现,增加免疫次数导致肿瘤组织中灶性坏死增加,淋巴细胞浸润增加,且肿瘤细胞病理性核分裂相减少,提示了该疫苗作用的可能机制。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

结核分枝杆菌蛋白抗原的研究进展

结核病当今世界人类致死的主要疾病之一,早期诊断发现病人、选择敏感的抗结核药物进行有效治疗是控制结核病的关键。而临床上对结核病患者检出率低,漏诊率和误诊率高,结果导致结核耐药的情况越来越严重。简便、快速、准确的免疫学检测方法在诊断结核病中起到了重要的作用。本文对用于免疫学检测的蛋白抗原作一综述。     

结核分枝杆菌HspX蛋白的原核高效可溶性表达及产物抗原性分析

目的:利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌HspX蛋白并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增HspX核酸序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western印迹初步评价HspX的抗原性。结果:经IPTG诱导,HspX蛋白在原核系统内获得了可溶性表达,经镍柱亲和层析获得了纯度达95%以上的重组蛋白。Western印迹结果证明重组HspX蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论:重组蛋白HspX在大肠杆菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。