衣霉素诱导大鼠心肌细胞内质网应激凋亡模型的构建

目的:通过衣霉素诱导内质网应激建立新生大鼠心肌细胞凋亡模型。方法:不同浓度、不同时间的衣霉素作用于原代培养乳鼠心肌细胞,通过MTT实验和流式细胞术测定心肌细胞的存活率和凋亡率,Western blot检测内质网应激蛋白GRP78,CHOP表达水平。结果:①与阴性对照组相比,衣霉素具有损伤心肌细胞的作用,并呈现剂量与时间依赖关系(P<0.05,n=12)。②通过流式细胞术判断心肌细胞死亡的性质,当衣霉素浓度为100ng/ml,作用72h时,心肌细胞存活率和凋亡率分别为57.4±3.2%(n=12),25.9±5.8%(n=3)。提示衣霉素损伤细胞的形式主要为凋亡性死亡。③内质网应激蛋白GRP78和CHOP表达于6h开始增加,24h达到峰值,随后呈下降趋势。结论:应用衣霉素成功诱导SD乳鼠心肌细胞内质网应激凋亡模型,衣霉素的最佳诱导浓度为100ng/ml,作用时间为72h。     

拉西地平对内质网应激导致左室重塑的保护作用

目的：研究在高温高湿应激状态下拉西地平对葡萄糖调节蛋白（glucose-regulated protein78,GRP78）和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）在大鼠心肌中表达及对心室重塑的影响。方法：将30只雄性Sprague-Dawly（SD）大鼠随机分为对照组、高温高湿组、拉西地平干预组,每组10只。喂养6周后颈动脉插管测定平均动脉压及心率。B超检测左室形态结构。免疫组化法检测大鼠心肌GRP78及CHOP蛋白及表达水平。结果：高温高湿组的大鼠平均动脉压（MBP）、隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（LPWT）、左室重量指数（LVWI）,GRP78及CHOP蛋白表达水平与对照组相比均有显著升高（p〈0.01）,拉西地平干预组能显著降低大鼠平均动脉压（MBP）、室间隔厚度（IVST）、左室重量指数（LVWI）,GRP78及CHOP蛋白的表达水平（p〈0.05）。结论：内质网应激可能参与了高温高湿诱导的左室重构;拉西地平可能通过降低GRP78及CHOP的表达干预了ERS介导的心肌肥厚通路,从而改善心脏功能。     

拉西地平对内质网应激导致左室重塑的保护作用

目的:研究在高温高湿应激状态下拉西地平对葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein78,GRP78)和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)在大鼠心肌中表达及对心室重塑的影响。方法:将30只雄性Sprague-Dawly(SD)大鼠随机分为对照组、高温高湿组、拉西地平干预组,每组10只。喂养6周后颈动脉插管测定平均动脉压及心率。B超检测左室形态结构。免疫组化法检测大鼠心肌GRP78及CHOP蛋白及表达水平。结果:高温高湿组的大鼠平均动脉压(MBP)、隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LPWT)、左室重量指数(LVWI),GRP78及CHOP蛋白表达水平与对照组相比均有显著升高(p<0.01),拉西地平干预组能显著降低大鼠平均动脉压(MBP)、室间隔厚度(IVST)、左室重量指数(LVWI),GRP78及CHOP蛋白的表达水平(p<0.05)。结论:内质网应激可能参与了高温高湿诱导的左室重构;拉西地平可能通过降低GRP78及CHOP的表达干预了ERS介导的心肌肥厚通路,从而改善心脏功能。     

CHOP双重调控衣霉素诱导的DU-145细胞凋亡及自噬的研究

目的研究内质网应激分子CHOP调控细胞凋亡与自噬的作用和机制。 方法利用衣霉素诱导DU-145细胞产生内质网应激,Western Blot法检测内质网应激相关分子Grp78、Grp94、p-eIF2α和CHOP及自噬蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclin1的表达;用流式细胞术检测细胞凋亡水平;沉默CHOP基因,用Western Blot法检测凋亡蛋白PARP、Caspase3的表达,流式细胞术检测细胞凋亡;并利用免疫荧光检测自噬标志性蛋白LC3B的表达。 结果衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激能诱导一定程度的细胞凋亡,衣霉素处理8、12、24?h的细胞凋亡率分别为3.27﹪±1.02﹪,8.97﹪±0.71﹪和11.67﹪±1.41﹪,处理12?h及24?h的细胞凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.01）。同时也能通过抑制PI3K/AKt/mTOR信号通路激活DU-145细胞自噬。CHOP基因沉默抑制细胞凋亡,shCtrl组细胞凋亡率为32.17﹪±3.93﹪,shCHOP-1组细胞凋亡率为23.53﹪±3.41﹪,两组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）。且CHOP基因沉默能促进细胞自噬分子LC3B的表达。 结论衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激状态下,CHOP在细胞凋亡与自噬之间发挥双重调控作用。     

银杏叶提取物对AGEs诱导心肌细胞内质网应激的影响

目的：探索银杏叶提取物对晚期糖基化终产物（AGEs）作用下心肌细胞损伤以及内质网应激标记性分子GRP 78和CHOP的影响。方法：原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,随机分为对照组、AGEs组、AGEs＋银杏叶提取物组。MTT法检测心肌细胞存活率,Western blot法检测GRP 78和CHOP蛋白表达水平。结果：与对照组比较,AGEs组48、72 h时心肌细胞存活率降低;与AGEs组比较,银杏叶提取物处理增加心肌细胞存活率。与对照组比较,AGEs组GRP 78和CHOP蛋白表达水平显著升高;与AGEs组比较,银杏叶提取物组GRP 78和CHOP表达水平显著下调。结论：银杏叶提取物能够抑制AGEs诱导的心肌细胞损伤,其机制可能与拮抗GRP 78和CHOP的表达,减轻内质网应激有关。     

CHOP/GADD153 在内质网应激介导细胞凋亡中的研究进展

内质网(endoplasmic reticulum,ER)广泛存在于真核细胞中,是负责细胞中分泌性蛋白合成和折叠的细胞器。20世纪70年代开始发现了许多干扰内质网功能的因素可直接或间接使内质网中未折叠的蛋白质堆积,使细胞处于应激状态(ER stress),细胞通过未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)来适应内质网应激。未折叠蛋白质反应途径(UPR pathway)是一种信号转导途径,最早在酵母中阐明。近年来对哺乳动物细胞未折叠蛋白质反应途径的研究也获得了重要成果。毒性、缺氧、病毒感染等不良刺激可使细胞内环境的稳态受到破坏,诱发一系列内质网应激反应(ER stress)来维持细胞的正常功能。当细胞受到持续而强烈的刺激时,不能缓解内质网应激状态,细胞会走向凋亡。近年来的研究发现,CHOP/GADD153作为一种前凋亡分子,在内质网应激介导的细胞凋亡中发挥着重要作用,参与肿瘤、阿尔茨海默、糖尿病等诸多疾病的发生和发展过程。     

蒙药新Ⅱ号对扩张型心肌病大鼠心功能、心肌细胞内质网应激及凋亡的作用

目的：探讨蒙药新Ⅱ号对阿霉素性扩张型心肌病大鼠心功能、心肌病理、心肌细胞内质网应激及凋亡作用。方法：30 只SD 雄性大鼠分为3组（n=10）： 正常对照组、模型组（腹腔注射阿霉素2 mg/kg体重,1次/周,用药4周后观察4周）和蒙药新Ⅱ号组（腹腔注射阿霉素2 mg/kg体重,1次/周,用药4周后,给予蒙药新Ⅱ号30 mg/kg·d灌胃,共4周）。观察大鼠的一般情况,8 周后行高频超声心动图检查,测定各项心功能指标,检查结束后处死大鼠,取心脏,行HE 染色、VG染色及电镜观察。用TUNEL 法检测各组大鼠心肌细胞凋亡, Western blot 检测各组大鼠心肌细胞内质网伴侣蛋白GRP78、GRP94及促凋亡因子CHOP、caspase-3表达。结果：与模型组相比较,①蒙药新Ⅱ号组大鼠心脏左室结构及血流动力学各项指标均有明显改善（P<0.05）。②蒙药新Ⅱ号组大鼠心肌病理积分明显下降（P<0.01）。③蒙药新Ⅱ号组大鼠心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94、CHOP、caspase-3表达及细胞凋亡明显减少 （P<0.01）。结论：蒙药新Ⅱ号可改善扩张型心肌病大鼠心脏功能,减轻心肌病理变化,缓解内质网应激,减少心肌细胞凋亡。这一实验结果可能是蒙药新Ⅱ号治疗扩张型心肌病作用机制之一。     

拉西地平对高温高湿应激大鼠血管平滑肌细胞GRP78和CHOP表达的影响

目的：探讨钙离子拮抗剂拉西地平对高温高湿应激大鼠血管平滑肌细胞内内质网应激相关因子葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein of 78kD,GRP78）和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP）表达的影响。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为对照组、高温高湿组、拉西地平组,每组20只。按实验时间（2w、4w、6w、8w）的不同,各组又分为4个亚组,每个亚组5只大鼠。用颈动脉插管法测定各组大鼠的平均动脉压（MAP）;用免疫组织化学法检测GRP78和CHOP的表达水平。结果：①高温高湿各组的MAP随着实验时间的延长呈逐渐递增的趋势,高温高湿4w、6w、8w亚组的MAP均显著高于相应的对照组和拉西地平组（P〈0.05）。②随着实验时间的延长,高温高湿组GRP78表达量不断增加,6w达到最大值,8w表达减弱。高温高湿4w、6w、8w亚组GRP78表达量均高于相应对照组和拉西地平组,有显著性差异（P〈0.05）。③高温高湿组2w、4w、6w、8w亚组CHOP表达量组间比较有显著性差异（P〈0.05）,8w亚组表达达到最高值;高温高湿组6w、8w亚组与相应对照组和拉西地平组比较有显著性差异（P〈0.05）。结论：高温高湿应激可引起血管平滑肌细胞内质网应激反应,导致GRP78表达及CHOP表达的不对称增加,提示高温高湿应激可引起血管平滑肌细胞的损害;拉西地平可以减轻内质网应激,逆转高温高湿应激所致的血管平滑肌细胞的损伤作用,对血管平滑肌细胞有保护作用。     

拉西地平对高温高湿应激大鼠血管平滑肌细胞GRP78 和CHOP 表达的影响

目的:探讨钙离子拮抗剂拉西地平对高温高湿应激大鼠血管平滑肌细胞内内质网应激相关因子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein of 78kD,GRP78)和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)表达的影响。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为对照组、高温高湿组、拉西地平组,每组20只。按实验时间(2w、4w、6w、8w)的不同,各组又分为4个亚组,每个亚组5只大鼠。用颈动脉插管法测定各组大鼠的平均动脉压(MAP);用免疫组织化学法检测GRP78和CHOP的表达水平。结果:①高温高湿各组的MAP随着实验时间的延长呈逐渐递增的趋势,高温高湿4w、6w、8w亚组的MAP均显著高于相应的对照组和拉西地平组(P<0.05)。②随着实验时间的延长,高温高湿组GRP78表达量不断增加,6w达到最大值,8w表达减弱。高温高湿4w、6w、8w亚组GRP78表达量均高于相应对照组和拉西地平组,有显著性差异(P<0.05)。③高温高湿组2w、4w、6w、8w亚组CHOP表达量组间比较有显著性差异(P<0.05),8w亚组表达达到最高值;高温高湿组6w、8w亚组与相应对照组和拉西地平组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:高温高湿应激可引起血管平滑肌细胞内质网应激反应,导致GRP78表达及CHOP表达的不对称增加,提示高温高湿应激可引起血管平滑肌细胞的损害;拉西地平可以减轻内质网应激,逆转高温高湿应激所致的血管平滑肌细胞的损伤作用,对血管平滑肌细胞有保护作用。     

内质网应激预处理条件下大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的建立

目的:通过建立了内质网应激预处理条件下的大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,探讨内质网应激预处理在体内的应用.方法:以衣霉素为内质网应激诱导剂,采用大鼠肝脏70%缺血再灌注损伤模型.按照不同给药剂量分为50μ g/kg组、100μ g,kg组、200μ g/kg组、对照组,观察不同给药剂量条件下,血清转氨酶水平的变化.结果:给药100μ g/kg体重、诱导5天条件下大鼠术后转氨酶水平显著低于对照组.其它组与对照组无统计学差异.肝组织病理切片证实该预处理条件对肝脏缺血再灌注损伤有显著保护作用.结论:在特定的给药剂量条件下,衣霉素诱导的内质网应激预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤有显著的保护作用.     

Prion Protein Protects Cancer Cells against Endoplasmic Reticulum Stress Induced Apoptosis

Unfolded protein response(UPR) is an adaptive reaction for cells to reduce endoplasmic reticulum(ER) stress. In many types of cancers, such as lung cancer and pancreatic cancer, cancer cells may harness ER stress to facilitate their survival and growth. Prion protein(PrP) is a glycosylated cell surface protein that has been shown to be up-regulated in many cancer cells. Since PrP is a protein prone to misfolding, ER stress can result in under-glycosylated PrP, which in turn may activate ER stress. To assess whether ER stress leads to the production of under-glycosylated PrP and whether underglycosylated PrP may contribute to ER stress thus leading to cancer cell apoptosis, we treated different cancer cells with brefeldin A(BFA), thapsigargin(Thps), and tunicamycin(TM). We found that although BFA, Thps, and TM treatment activated UPR, only ATF4 was consistently activated by these reagents, but not other branches of ER stress. However, the canonical PERK-eIF2α-ATF4 did not account for the observed activation of ATF4 in lung cancer cells. In addition, BFA,but neither Thps nor TM, significantly stimulated the expression of cytosolic PrP. Finally, we found that the levels of PrP contributed to anti-apoptosis activity of BFA-induced cancer cell death. Thus, the pathway of BFA-induced persistent ER stress may be targeted for lung and pancreatic cancer treatment.     

大鼠严重烧伤后心肌细胞GRP94表达变化及其意义

目的观察严重烧伤大鼠心肌细胞内质网应激蛋白表达的改变及其意义,以探讨严重烧伤后心肌损伤与内质网应激的关系。方法建立大鼠30％Ⅲ度烫伤模型,酶联免疫法检测血浆中心肌肌钙蛋白T（cTnT）含量,放射免疫法检测血浆中TNFα的含量,RT-PCR和免疫组化分析GRP94的表达。结果烧伤组大鼠伤后3h血浆中cTnT含量即呈显著升高（P〈0．01）,心肌中GRP94 mRNA和蛋白表达于烧伤后3h显著性升高,12h达峰值,24h还呈显著升高;大鼠烧伤后3h心肌中Caspase-3活性开始升高,12h达高峰,48h后仍显著高于对照组。牛磺酸治疗组GRP94的表达和Caspase-3活性较烧伤组均有显著性降低（P〈0．05）。结论严重烧伤可引起心肌细胞内质网应激,牛磺酸对烧伤后早期心肌损害有保护作用。     

藏红花素诱导人胶质瘤U251细胞内质网应激性凋亡的研究

目的：研究藏红花素对人胶质瘤U251细胞的促凋亡作用和可能的机制。方法：不同浓度藏红花素处理U251细胞后,MTT法检测细胞活力,TUNEL染色观察细胞凋亡情况。结果：①藏红花素显著抑制U251细胞的增殖,并诱导其发生凋亡。②藏红花素增加了U251细胞胞浆内钙离子的含量,并上调了内质网分子伴侣GRP78的表达。③藏红花素处理后的U251细胞内质网相关凋亡分子CHOP,Caspase-4,JNK活性明显增高。结论：藏红花素通过诱导内质网应激性凋亡抑制人胶质瘤U251细胞的增殖。     

Neuronal Apoptosis Induced by Endoplasmic Reticulum Stress

Apoptosis is a conserved active cellular mechanism occurring under a range of physiological and pathological conditions. In the nervous system, apoptosis plays crucial roles in normal development and neuronal degenerating diseases. Various deleterious conditions, including accumulation of the mutant proteins in the endoplasmic reticulum (ER) and inhibition of ER to Golgi transport of proteins, may result in apoptosis. In this study, we examined the downstream events of apoptosis in differentiated PC 12 cells under ER stress induced by brefeldin A, an inhibitor of ER to Golgi protein transport. Activation of NF-B and degradation of I-B were observed within 2 hours, followed by up-regulation of GRP78 protein level in treated cells. Caspase-12 only appeared around 24 hours after brefeldin A treatment, coincident with cell nuclei fragmentation. These results suggest that neuronal apoptosis may be induced by ER stress through a NF-B and caspase related pathway.     

藏红花素诱导人胶质瘤U251细胞内质网应激性凋亡的研究

目的:研究藏红花素对人胶质瘤U251细胞的促凋亡作用和可能的机制。方法:不同浓度藏红花素处理U251细胞后,MTT法检测细胞活力,TUNEL染色观察细胞凋亡情况。结果:①藏红花素显著抑制U251细胞的增殖,并诱导其发生凋亡。②藏红花素增加了U251细胞胞浆内钙离子的含量,并上调了内质网分子伴侣GRP78的表达。③藏红花素处理后的U251细胞内质网相关凋亡分子CHOP,Caspase-4,JNK活性明显增高。结论:藏红花素通过诱导内质网应激性凋亡抑制人胶质瘤U251细胞的增殖。     

内质网应激诱导自噬的分子机制

在真核细胞中,内质网对蛋白质的折叠和运输至关重要,多种病理因素对内质网稳态的扰乱,可导致内质网腔中未折叠或错误折叠蛋白蓄积,即内质网应激(ERS)。细胞为此通过激活一种叫做未折叠蛋白反应(UPR)的防御反应来恢复内质网稳态。自噬是一种被描述为"自我吞食"的细胞代谢过程,其通过批量清除和降解未折叠蛋白以及破损细胞器在ERS时作为一种重要的保护机制。近年的研究显示这两个系统动态互联,且ERS可以通过多种方式诱导自噬的发生。在本文中,我们将总结目前关于ERS尤其是UPR诱导自噬的分子机制的相关知识,以进一步指导关于ERS与自噬关系的的研究。     

内质网应激与疾病

内质网是蛋白质合成与折叠、维持Ca²⁺动态平衡及合成脂类和固醇的场所。遗传或环境损伤引起内质网功能紊乱导致内质网应激,激活未折叠蛋白反应。未折叠蛋白反应是一种细胞自我保护性措施,但是内质网应激过强或持续时间过久可引起细胞凋亡。因此,内质网应激与众多人类疾病的发生发展密切相关。最近研究证明,癌症、炎症性疾病、代谢性疾病、骨质疏松症及神经退行性疾病等有内质网应激信号传递参与。然而内质网应激作为一个有效靶点参与各种疾病发挥作用的功能和机制仍然有待进一步研究。在近年来发表的文献基础上对内质网应激与疾病的关系,以及其可能的作用机制进行综述。     

抑制或激活泛素-蛋白酶体途径对大鼠肺泡巨噬细胞内质网应激的影响

目的:研究肺泡巨噬细胞(NR8383)不同蛋白酶体激活程度对内质网应激的影响。方法:构建UbG76V-GFP融合蛋白,将含有UbG76V-GFP的质粒导入NR8383细胞,筛选出可稳定表达UbG76V-GFP的细胞系,通过蛋白酶体抑制剂(MG132)、蛋白酶体激活剂(阿霉素)干预蛋白酶体活性。荧光显微镜观察不同蛋白酶体活性下大鼠肺泡巨噬细胞在缺氧复氧2 h、4 h、6 h时蛋白酶体活性,Western blot及PCR技术检测不同蛋白酶体活性下大鼠肺泡巨噬细胞在缺氧复氧2 h、4 h、6 h时泛素化蛋白及内质网应激相关基因的表达。结果:在缺氧复氧2 h、4 h、6 h这3个时间点,加入MG132组大鼠肺泡巨噬细胞绿色荧光及泛素化蛋白(Ubiquitin)表达明显降低(P0.05),而PCR及Western blot示内质网应激基因BIP(免疫球蛋白结合蛋白)、XBP-1(X-盒结合蛋白)和CHOP(C/EBP同源蛋白)平均扩增量及蛋白表达量明显增加(P0.05);加入阿霉素组大鼠肺泡巨噬细胞在缺氧复氧2 h、4h、6 h表现出相反的实验结果,绿色荧光及Ubiquitin蛋白相对表达均明显增加(P0.05),而PCR及Western blot示内质网应激基因BIP、XBP-1和CHOP平均扩增量及蛋白表达量明显增加(P0.05)。结论:本实验结果表明活细胞泛素-蛋白酶体活性程度与内质网应激存在紧密联系,外源性增强泛素蛋白酶体活性会抑制内质网应激,外源性减弱泛素蛋白酶体活性会增强内质网应激。