花粉原生质体,精子与生殖细胞的实验操作

当前,一个可以称为“植物实验生殖生物学”的分支学科正在形成之中。其主要特点是:由以往实验胚胎学的器官、组织水平的操作发展为细胞、原生质体水平的操作;由传统的比较单一的研究发展为多学科的综合性研究;因而无论在研究的手段与内容方面均进入更高的层次。例如,就雄性系统而言,已由花药培养发展到花粉粒培养,最近又向花粉原生质体、精子和生殖细胞的操作深化。就雌性系统而言,亦由子房、胚珠培养向胚     

花粉生殖细胞的大量分离与纯化

被子植物的花粉生殖细胞是精子的前体,在生殖过程中占有重要地位。由于它被营养细胞与花粉壁包围,一般只能以花粉粒为单位进行研究。1986年以来,我们用压片法分离出花粉生殖细胞,作了有关细胞生物学研究,同时指出分离的生殖细胞用于离体培养与遗传操作的意义。作者参考了 Russell 分离精子的一步“渗透压冲击法”,建立了适于大量分离与纯化生殖细胞的“二步渗透压冲击法”(以下简称“二步法”)。此外,还作     

烟草花粉原生质体与叶肉原生质体的融合及培养早期变化

用ＰＥＧ—高Ｃａ高ＰＨ法诱导抗卡那霉素的烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）品系Ｎ３６４＋Ｋｍ＋花粉原生质体和黄花烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｒｕｓｔｉｃａ）叶肉原生质体融合。幼嫩花粉原生质体和叶肉原生质体之间的融合体培养启动胚胎发生分裂,经卡那霉素筛选后,少数多细胞团存活并形成小愈伤组织。成熟花粉原生质体与叶肉原生质体之间的融合体则仅产生管状结构。这一结果表明,作为融合一方的花粉原生质体的发育时期对融合产物的发育途径有重要影响。     

阳春砂花粉的结构和生殖细胞的分离

阳春砂为自交植物,但花的雌蕊高于雄蕊,是研究单子叶植物纲生殖细胞分子生物学的典型材料。为了解决授粉难的问题,该研究采用植物组织化学方法,对阳春砂花粉的发育过程进行观察,以明确其花粉的结构特征;选择渗透压冲击法分离生殖细胞,以探讨阳春砂的授粉技术方法。结果表明:(1)阳春砂花粉发育的特殊性从四分体时期开始,在四分体时期缺少典型的胼胝质壁,而4个小孢子是由多糖性质的细胞壁分隔、包裹着;成熟的阳春砂花粉粒是二胞型花粉,且花粉细胞质中含有丰富的多糖淀粉和脂滴物质;成熟花粉外壁是由多糖物质构成,而非胡萝卜素和类胡萝卜素酯的孢粉素物质构成。(2)阳春砂花粉在2%甘露醇+5%丙酮的爆破液中,爆破率可达10.67%,并释放出花粉内含物,其中包含生殖细胞;在释放出的花粉细胞质中,生殖细胞可完整保留约30min;用显微操作仪将游离的生殖细胞收集成一定数量的群体,置离心管后即可保存在液氮罐中,每天可收集上百个阳春砂生殖细胞。     

多种被子植物花粉生殖细胞大量分离技术的比较研究

从11种植物的成熟花粉粒中分离出大量生活的生殖细胞。比较了四种分离方法(一步渗透压冲击法、二步渗透压冲击法、低酶法和花粉原生质体释放法)在不同植物中的效果。归纳出三类植物适于采用三种分离方法。研究了影响分离效果的若干重要因素。对5种植物的分离生殖细胞进行了纯化。经鉴定,纯化的细胞群体中80%以上的细胞是生活的。     

柽柳花粉的萌发及生殖细胞活动的观察

被子植物的花粉粒是一个极简化的雄配子体。成熟的花粉粒具两种结构形式。即有二细胞的和三细胞的类型。其中,二细胞型花粉的植物约占70％。利用花粉的萌发,观察生殖细胞在花粉管中的活动,对于认识和理解被子植物有性生殖过程非常重要。以分布广泛、花期较长的柽柳为材料．介绍了花粉培养、染色、制片的简易步骤和方法,并对观察的内容特别是花粉管内容物的释放作了简要说明。     

甘蓝型油菜和紫菜苔花粉原生质体的大量分离

第一次由两种芸苔属作物甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和紫菜苔(B.campestris var-purpurea)的成熟花粉中成功地分离出大量原生质体。分离率最高分别达66.7%与70.4%。绝大多数花粉原生质体是生活的。在分离技术上,改进了原来在几种单子叶植物中所用的水合与酶解同时进行的“一步法”,建立了适于油菜和紫菜苔的“二步法”,即:首先将花粉经长时间水合吸胀,脱去外壁获得仅有内壁的花粉;然后通过酶解除去内壁获得花粉原生质体。研究了影响水合与酶解两个过程的各种因素。     

萱草幼嫩花粉原生质体培养启动细胞分裂的超微结构研究

萱草(Hemerocallis fulva L.)幼嫩花粉,即后期小孢子原生质体在培养8天时进入有丝分裂或已形成二个细胞。此外,还观察到游离核分裂、无丝分裂、微核形成等现象。这显示了花粉原生质体分裂方式的多样性。在启动分裂时发生一系列变化:如细胞核移位、大液泡消失、细胞质电子密度增加、细胞器增多、质体不含淀粉等。再生的细胞壁含许多小泡,很少纤丝,表现出现有培养条件下壁的形成能力薄弱。这是今后改进培养技术需要特别注意的问题。     

三种植物花粉原生质体的大量分离与初步培养

利用花粉水合导致外壁破裂,使内壁得以酶解,分离出鸢尾（Iris tectorum Maxim),风雨花（Zephyranthes grandiflora Lindl)和萱草（Hemerocallis fulva L.)三种植物成熟花粉的原生质体。初步分离出萱草四分体至成熟花粉（单核早期除外）各时期的原生质体,经过纯化处理,获得较纯净的有生活力的原生质体群体,萱草花粉原生质体的培养实现了细胞壁再生,管状及其它多种结构的形成以及生殖核的一、二次分裂。     

青菜与芥菜花粉－体细胞原生质体融合的研究

以聚乙二醇（ＰＥＧ）为诱导剂,试验用４种方法进行青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体的融合,结果以修改的Ｔｅｒａｄａ等的方法最好。融合后原生质体的培养形成了愈伤组织,但未分化出芽,个别愈伤组织分化了根。用ＲＡＰＤ技术对任选的５个细胞系进行鉴定,发现１个细胞系含双亲的ＤＮＡ片段,可确认是青菜幼嫩花粉原生质体与芥菜下胚轴原生质体融合后产生的杂种细胞系。     

烟草幼嫩花粉原生质体分离与早期离体发育

建立了两种分离烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ）幼嫩花粉原生质体的方法：一为通过花药漂浮培养释放出外壁裂开的花粉,后者转入酶液彻底脱去外壁,内壁降解而分离出原生质体（简称“花药预培养法”）;二为花粉经饥饿处理后,转入酶液释放原生质体（简称“花粉饥饿预处理法”）。对影响分离效果的主要因素作了研究。用花药预培养法分离的幼嫩花粉原生质体,在Ｋ３ 培养基中可再生细胞壁,启动１ 次细胞分裂,或萌发花粉管。表明具有孢子体发育与配子体发育的潜能。观察到花粉原生质体分裂成二细胞后,其中１ 个子细胞又长出花粉管的稀有现象,暗示其开始启动孢子体发育后又重新恢复配子体发育途径