利用TA克隆的方法简便构建入门克隆

Gateway技术是一种通用型克隆方法,其基于λ噬菌体位点特异性重组,将目的DNA快速克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上,不需要进行酶切和连接反应。但存在获得入门克隆过程中相关反应酶制剂价格昂贵,且药品订购时间较长等问题。通过对入门载体pDONR207的改造,使之产生3’端具有单个T 末端的线性化的入门载体,采用TA克隆的方法替代BP反应,从而简便、经济和快速地获得入门克隆。利用改造后的Gateway技术构建拟南芥SOS2基因的原核表达载体和真核表达载体,通过原核表达和原生质体瞬时表达证明通过此方法构建的表达载体在原核细胞和真核细胞中都得到了很好的表达。     

转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。     

T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速Gateway克隆系统

Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用Gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点“core attL”的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入pMD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到pMD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。     

通路克隆入门载体pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*的构建及其应用

为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台.     

含有Rubisco小亚基启动子和转运肽序列的通路克隆入门载体的构建和应用

Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR-2B的XmnⅠ位点改造成HindⅢ位点,产生入门载体pENTR*-2B,然后将番茄1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基3C的启动子(PrbcS)及其转运肽序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因亚克隆到pENTR*-2B中,构建通路克隆入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP.实验结果证实,用pENTR*-PrbcS-*T-GFP和通路克隆的植物表达载体进行LR反应,构建GFP的光诱导型植物表达载体,可以成功地将表达的GFP定位到转基因植物的叶绿体中.利用β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因替代该入门载体中的GFP基因做试验也得到相似的结果.这说明用目的基因替换该入门载体中的GFP可以构建目的基因的入门载体,然后用通路克隆技术可以快速构建其光诱导型植物表达载体,将表达的目的蛋白定位到转基因植物或组织细胞的叶绿体中.     

一种高效低背景T载体的构建

介绍一种构建高效低背景T载体的通用方法。使用含有ccdB致死基因的gateway cassette 片段作为插入DNA片段以降低背景干扰,连接到pGEM-T easy 载体骨架上,通过内切酶XcmI酶切重组质粒即得到T 载体。对重组质粒进行了酶切,PCR 和测序验证,并且利用连接效率实验证实了T 载体具有100% 的阳性克隆率。构建的T载体不仅继承了pGEM-T easy的众多优点,而且具有高效、低背景的卓越特点;另外,引入的常用限制性内切酶和 LR重组反应介导的gateway 技术为亚克隆提供了便利。     

人PRKAG2全长基因的体外拼接及TA克隆载体的构建

目的:应用体外基因拼接及TA克隆技术构建含PRKAG2基因的载体.方法:通过商业途径购得PRKAG2基因的一个转录变体cDNA质粒(GenBank登记号BC 068598),其在N端缺失了44个氨基酸,根据已知的PRKAG2基因序列(GenBank登记号NM_016203),设计搭桥引物及序列扩增引物,通过PCR搭桥方法,合成完整全序列的PRKAG2基因,并将其克隆到TA载体,将得到的阳性克隆测序鉴定.结果:拼接出全长1759bp的PRKAG2基因,目的基因连接到载体后测序与设计的PRKAG2基因完全一致.结论:成功的构建了全长人PRKAG2基因的TA克隆,为进一步研究PRKAG2基因的功能提供了模板.     

用于通路(Gateway)克隆技术的植物表达载体研究进展

通路(Gateway)克隆技术是根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发的一套分子克隆新技术.利用该技术LR反应构建目的基因的表达载体时不需要经过酶切和连接等繁琐而又费时的过程,因此,可以节省很多时间.为了扩大Gateway技术在植物基因工程领域的应用,最近有很多研究机构和研究小组开发了能用于组成型或诱导型表达目的基因、基因沉默、启动子分析、蛋白质亚细胞定位、蛋白质/蛋白质相互作用、多个DNA片段的模块化组装和DNA组片段功能验证等研究用的植物表达载体.该文对这些技术的研究进展进行了综述.     

质粒克隆载体研究进展

质粒克隆载体研究进展靳卫东宋增璇（中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室,天津３０００２０）关键词质粒克隆载体质粒是基因工程重要的载体之一。它是细胞内的共生型遗传因子,它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些特殊表型。质...     

酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。     

Development of the Gateway Recycling Cloning System for Multiple Linking of Expression Cassettes in a Defined Order,and Direction on Gateway Compatible Binary Vectors

A new antimicrobial compound was isolated from Scorodocarpus borneensis Becc. The chemical structure was determined to be methylthiomethyl (methylsulfonyl)methyl disulfide on the basis of its spectroscopic data. This compound exhibited considerably strong antimicrobial activities against all bacteria and fungi tested, except for Pseudomonas aeruginosa, with 12.5–25 μg/ml of MIC.     

Using a modified TA cloning method to create entry clones

We describe a noncommercial alternative method to create entry clones compatible with all kinds of destination vectors based on an improved TA cloning approach. To generate Gateway T vectors, we first constructed gentamicin- and chloramphenicol-resistant entry vectors designated pGWG and pGWC, respectively. Each entry vector contains an AhdI cassette flanked by attL sites, with each AhdI cassette containing two AhdI restriction enzyme sites spaced by the ccdB killer gene, which is lethal to most Escherichia coli strains. Gateway T vectors can be prepared by simple digestion of these entry vectors with the AhdI enzyme or its isoschizomers. The use of the ccdB gene as a negative selection marker is an important improvement over conventional TA cloning in that it eliminates the necessity of blue/white color screening based on alpha-complementation. Another important improvement that we have implemented is to retail the T vectors using Taq polymerase and dTTP so as to improve the cloning efficiency. Together, these improvements allow TA cloning to realize its full potential. Using Gateway T vectors prepared by this improved method, entry clones for PCR products or restriction enzyme fragments can be created simply, efficiently, and inexpensively while at the same time introducing greater compatibility.     

以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建

目的:构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。方法:克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因,利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector(pH7WG2D)中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR-ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中,构建表达载体pCAMBIA1301-xylA-GW,利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应,获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5,并导入根癌农杆菌LBA4404中。结果:抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5。结论:利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体,可简化、方便植物转基因表达载体构建。     

Development of Gateway Binary Vectors,R4L1pGWBs,for Promoter Analysis in Higher Plants

We developed a new series of Gateway binary vectors for plant transformation, R4L1pGWBs, which allow easy construction of promoter:reporter clones. R4L1pGWBs contain a recombination attR4-attL1-reporter cassette, and thus an attL4-promoter-attR1 entry clone was efficiently incorporated by the Gateway LR reaction, resulting in the generation of an attB4-promoter-attB1-reporter construct. The reporters employed in R4L1pGWBs were β-glucuronidase (GUS), luciferase (LUC), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), G3 green fluorescent protein (G3GFP), G3GFP-GUS, and tag red fluorescent protein (TagRFP).     

毛竹笋全长cDNA文库构建

Gateway技术构建cDNA文库,利用了λ噬菌体的位点特异性重组,避免使用限制性内酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。应用Gateway技术构建毛竹笋cDNA文库,经检测cDNA入门文库的滴度达到1.7×106cfu/mL,文库总容量为8.5×106cfu,平均插入片段在1.0 kb以上。毛竹笋文库的构建为进一步克隆毛竹纤维化分子机理打下了基础。     

Development of R4 Gateway Binary Vectors (R4pGWB) Enabling High-Throughput Promoter Swapping for Plant Research

We developed a new series of Gateway binary vectors, R4pGWBs, that are plant transformation vectors designed for one-step construction of chimeric genes between any promoter and any cDNA. The structure of R4pGWBs is almost the same as the promoterless type of improved pGWBs (ImpGWBs), except that the attR1 site is replaced with attR4, which enables tripartite recombination of these vectors with promoter- and cDNA-entry clones. While ImpGWBs are suitable for promoter analysis and constitutive expression of cDNAs in higher plants, R4pGWBs have a great advantage in expressing a cDNA under the regulation of desired promoters.     

Development of a Series of Gateway Binary Vectors Possessing a Tunicamycin Resistance Gene as a Marker for the Transformation of Arabidopsis thaliana

We made two series of Gateway binary vectors, pGWBs and R4pGWBs, possessing a UDP-N-acetylglucosamine: dolichol phosphate N-acetylglucosamine-1-P transferase (GPT) gene driven by the nopaline synthase promoter (Pnos) as a tunicamycin resistance marker for the transformation of Arabidopsis thaliana. The reporters and tags employed in this system are sGFP, GUS, LUC, EYFP, ECFP, G3GFP, mRFP, TagRFP, 6xHis, FLAG, 3xHA, 4xMyc, 10xMyc, GST, T7, and TAP. Selection of transformants was successful on plates containing 0.15 mg/L of tunicamycin. These vectors were compatible with existing pGWB and R4pGWB vectors for kanamycin, hygromycin B, and BASTA^® selection, and are useful new tools for making transgenic Arabidopsis.     

cIts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体

从噬菌体λＤＮＡ（ｃＩｉｎｄｌｔｓ８５７Ｓａｍ７）克隆出９９０ｂＰ的ｃＩｔｓ８５７基因,经缺失,点突变等修饰改造和ＤＮＡ序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型ｃＩｔｓ８５７基因（７７０ｂｐ）。进而利用它构建大肠杆菌表达载体ｐＢＬＭＶＬ２和一套含３种不同阅读框架ｌｉｎｋｅｒ区的表达载体ｐＢＬＭＦＶ４、５Ｂ、６。上述表达载体;用于表达人工合成的牛生长激素（ｂＧＨ）、人干扰素－γΔＣ－１３和酵母ｐｈｏ８５等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。这些表明,克隆、修饰并组建到表达载体中的λ噬菌体ｃＩｔｓ８５７基因表达出具有功能作用的转录阻遏蛋白,使上述ＰＬ启动子控制下的大肠杆菌表达载体可经温敏诱导而高效表达外源基因产物．