新型多重PCR方法及其在呼吸道病毒诊断上的应用

急性呼吸道感染广泛分布于人群中,主要由呼吸道病毒引起,在老年人和婴幼儿中具有较高的发病率和死亡率,给社会带来严重的经济负担。快速、准确检测出病原体对临床早期诊断和指导治疗有重要意义。多重聚合酶链式反应(PCR)技术具有PCR的高灵敏度和快速检测的特点,还能实现多病原的高通量检测。基于多重PCR技术开发的商业化试剂盒能同时检测12种以上的呼吸道病毒,能达到与实时荧光定量PCR(real-time PCR)相当的灵敏度和特异性,为呼吸道病毒的检测与分型提供了新的选择。本文综合了近年来的发展成果,对新型多重PCR方法的原理及其在呼吸道病毒诊断上的应用进行了综述。     

多重核酸检测技术研究进展

核酸检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点,被广泛应用于细菌、真菌、病毒、寄生虫的快速检测和鉴定,以及疾病的早期筛查与诊断中。随着生物检测技术的发展,基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用,主要包括以多重PCR、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术,这些技术可对多个靶标进行同时检测,具有快速、高通量、样品消耗少等特点。本文扼要介绍这些技术的原理,及其在病原检测、疾病诊断等方面的应用。     

呼吸道病毒感染核酸检测技术及其应用进展

急性呼吸道感染是全球范围内人类疾病和死亡的主要原因之一,其绝大部分是由呼吸道病毒所引起的。建立切实有效的实验室诊断技术,对于呼吸道病毒的防御和控制至关重要。以核酸为检测目的的分子诊断法,因其快速、简便、高通量、高灵敏度及高特异性,成为新一代呼吸道病毒检测的金标准。简要综述了呼吸道病毒感染核酸检测技术及其应用进展。     

七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术的初步建立

由呼吸道病毒引起的疾病严重威胁着人类的生命健康，为了建立一种快速高通量的呼吸道病毒核酸检测方法，本研究将多重PCR技术同液相芯片技术结合起来，针对呼吸道合胞病毒A型和B型、乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系、甲型流感病毒H1型和H3型以及新冠病毒等常见的七种呼吸道病毒，初步建立了七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术，评价了方法的特异性、敏感性和重复性，并使用来自安徽省疾控的25份临床急性期样本核酸对方法进行验证。结果显示，建立起的基于液相芯片多重核酸检测方法可特异性识别七种目标呼吸道病毒的靶基因序列，与包括副流感病毒在内的9种非目标呼吸道病毒无交叉反应。对七种病毒核酸进行十倍稀释液相检测，其中H3、BV、RSVB可以检出10²拷贝/μL,BY、RSVA和SARS-CoV-2可以检出10³拷贝/μL，对H1的检测限为10⁴拷贝/μL。25份样本核酸检测结果与实际相符。结果表明，本研究建立的七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术具有特异性强、敏感性高、稳定性好等特点，可用于临床样本的快速检测，为呼吸道类传染病的液相...     

多重PCR技术在病原检测中的应用

多重PCR能够同时扩增不同片段,具有普通PCR方法不可比拟的优势。简要论述了多重PCR在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测、支原体和衣原体及寄生虫的检测、微生物耐药性检测等方面的应用,分析了多重PCR的影响因素及条件优化,并进一步综述了多重PCR的应用前景。     

347例SARI病例15种常见呼吸道病原特征分析

了解新疆维吾尔自治区人民医院住院严重急性呼吸道感染(Severe acute respiratory infection,SARI)病例呼吸道病原的构成及主要病原的流行规律,为SARI的防控提供线索和依据。应用多重PCR方法对2015年8月至2016年7月期间在新疆维吾尔自治区人民医院儿科、呼吸科、急诊科住院,且符合SARI病例定义的每周二、周四、周六新入院的患者进行检测。347份标本中检出14种呼吸道病原,未检测出衣原体,检出病毒阳性标本144份,阳性率为41.50%,检出前4位的病毒依次是,流感病毒72份、鼻病毒18份、呼吸道合胞病毒15份、偏肺病毒和副流感病毒各13份,阳性率分别为为20.75%,5.19%,4.32%,3.75%,3.75%,检出细菌阳性标本数为155份,阳性率为44.67%,其中肺炎链球菌阳性108份、流感嗜血杆菌阳性62份,肺炎支原体阳性13份,阳性率分别为31.12%、17.87%、3.75%;在108份肺炎链球菌阳性标本中41份标本合并病毒感染。新疆维吾尔自治区人民医院SARI病例病原主要以流感病毒,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌为主,各年龄组均有检出,检出病原阳性高峰为冬春季;5岁及以下标本中检出腺病毒和百日咳杆菌会增加收住ICU的风险。     

常见呼吸道病毒多重PCR检测法的质量控制分析

急性呼吸道感染广泛分布于人群中,主要由呼吸道病毒引起,在老年人和婴幼儿中具有较高的发病率和死亡率。快速准确检测出病原体对临床早期诊断和指导治疗有重要意义。本文通过分析16种常见呼吸道病毒多重PCR检测法的质量控制关键环节和质量控制措施,对有效加强实验室质量管理,从而为提高实验室核酸检测质量水平提供了基本的参考数据。     

应用xMAP液念芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

应用xMAP液态芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的：建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法：根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果：xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论：xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

双色荧光多重PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用

为快速检测7种亚型禽流感病毒,对引物进行双色荧光标记,建立双色荧光多重PCR(DFM-PCR)方法,通过运用DFM-PCR可一次检测出7种禽流感病毒亚型。此方法为应用于病毒或病原等一些要求快速、高通量的检测领域打下基础,而且为禽流感病毒检测以及其他种类病毒等病原检测提供了一种新型方法。     

基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的猪呼吸道病毒多目标鉴定方法的建立和应用北大核心

【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV-2)和3型(porcine circovirus 3,PCV-3)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)以及猪博卡病毒1型(porcine bocavirus group 1,PBoV-G1)、2型(porcine bocavirus group 2,PBoV-G2)和3型(porcine bocavirus group 3,PBoV-G3)等呼吸道病毒的核酸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)高通量多目标检测技术。【方法】根据7种病原体基因的保守序列,分别设计不同病原的引物及对应的单碱基延伸探针,通过引物浓度和反应条件优化,方法特异性、敏感性和稳定性分析,以及临床样本和猪源产制品的检测验证,建立常见猪呼吸道DNA病毒的MALDI-TOF MS多目标检测体系。【结果】质谱分析显示,多目标检测体系的7种靶标产物峰只在特定病毒阳性样品检测时产生,与其他病原体检测无交叉反应,表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示,体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性符合率均≥98.0%,批间均≥98.3%,表明该方法具有较高的稳定性。体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65–26.27拷贝/μL之间,与荧光PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法相当。采用MALDI-TOF MS多重检测方法对100份组织、饲料和猪肉样品进行检测应用,检出2种及以上混合感染样品39份,其中5份样本同步检出5种病原体阳性;对8份ASFV-p72假病毒人工污染样品进行验证,均可检出ASFV阳性。将以上样本检测应用结果与荧光PCR方法进行比对验证,2种方法对于不同病原体检测结果的符合率高达94.4%–100%。【结论】本研究建立的基于MALDI-TOF MS的猪呼吸道常见DNA病毒多重检测方法为猪群相关疫病快速监测和鉴别诊断,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。     

食源性致病菌高通量检测方法及应用

食源性致病菌的体外培养一直是病原体诊断的金标准,但按照目前的培养技术仅有1％的细菌可以培养.目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有:多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、核酸等温扩增技术、焦磷酸测序技术和芯片技术等,本文介绍了这些高通量检测技术及其在食品病原微生物检测方面的应用情况.     

诺如病毒检测方法研究进展

诺如病毒是引起人类非细菌性胃肠炎的主要病原之一,具有很高的传染性和变异性,可导致严重的公共卫生问题,尤其在抵抗力弱的人群中有很高的发病率,因此开发快速、准确的检测技术对预防和控制诺如病毒的传播是非常重要的。本文综述了近年来RT-PCR、环介导等温扩增、实时荧光定量PCR、巢式PCR、ELISA、免疫层析、基因芯片等技术在诺如病毒检测中的应用及发展趋势。     

多重PCR技术在病原微生物检测中的应用进展

摘要：多重PCR技术能够同时扩增不同片段,具有高效、快捷、高度特异、敏感等优势,已经成为诸多实验室的常规诊断方法。本文简要论述了多重PCR技术的原理,在细菌病原体的检测、病毒病原体的检测及微生物耐药性检测等方面的应用, 并进一步阐述了多重PCR 的应用前景。     

呼吸道感染样本病毒宏基因组学技术及其应用进展

呼吸道感染在世界范围内造成巨大的医疗负担,导致呼吸道感染的病原非常多,快速准确判断感染病原对有效地预防控制及临床诊治至关重要。高通量测序及病毒宏基因组学技术近年来不断发展并越来越多地用于呼吸道感染的临床诊断及研究中。本文就呼吸道感染样本病毒宏基因组学技术(呼吸道感染样本前处理、高通量测序文库的准备、测序数据处理方法)及其应用进展进行简要的综述。     

PCR技术在植物病原细菌研究中的应用*

利用rep-PCR、AFLP和RAPD等多种基因组指纹分析方法,指纹图谱结合计算机辅助分析,用于研究植物病原细菌群体遗传多样性;遗传多样性图谱有助于理解病原细菌的分类、群体结构,还有利于设计特异、灵敏、快速检测策略用于植物病原检测和病害诊断。已有许多以PCR为基础的检测技术如rDNA-PCR、ITS-PCR、ARDRA等,有很多特异性引物及检测程序,已在植物病原检测和病害诊断中广泛应用。PCR技术的应用和计算机的辅助分析,为植物病原细菌群体动态和生态学知识提供了基本框架,使植物病理学进入一个新时代。     

PCR技术检测猪肺炎支原体的研究进展

猪肺炎支原体(Mycopiasma hyopneumoniae)是引起猪支原体肺炎的重要病原,该病常引起继发感染和混合感染,严重威胁养猪业发展,造成巨大的经济损失.利用PCR技术对猪支原体肺炎早期正确诊断具有非常重要的意义.从猪肺炎支原体的特异性靶基因、临床样品采集方法与样品DNA处理方法、关键技术因素及普通PCR技术、多重PCR技术、套式PCR技术、荧光定量PCR技术、芯片检测和环介导等温扩增技术等在猪肺炎支原体检测中的研究进展、主要优缺点及应用进行综述.     

PCR相关技术在植物病毒检疫检测中的应用

PCR和建立在PCR基础上的分子生物学技术以其灵敏、快速、简便等优点广泛应用于植物病毒的检测。阐述反转录聚合酶链式反应、免疫捕捉反转录PCR、PCR-单链构型多态性、实时荧光定量PCR、差异显示PCR和巢式PCR等相关技术的原理及其在植物病毒检测中的应用现状,以期为我国植物病毒的检疫检测提供有益参考。     

食源性致病菌多重分子生物学检测技术研究进展

快速、可靠的食源性致病菌高通量检测方法对于确保食品安全具有重要意义,近年基于DNA水平的多重分子生物学检测技术迅速发展,针对各种不同的食源性致病菌建立了多种多重分子检测技术,包括多重PCR、多重实时荧光PCR以及基因芯片等。对这些多重分子检测技术的最新研究进展作一综述,并且建议在今后该技术的研究中,仍需要在食品中多种致病菌同时选择性增菌培养、亚致死损伤修复以及检测内标的构建等方面取得突破,从而能够更好地实现食源性致病菌的高通量检测。     

多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用

根据基因库中对虾桃拉综合征病毒（TSV）、白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT—PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT—PCR。该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp（TSV）、593bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的特异性多重RT—PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pgTSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I—HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。