猪7种腹泻相关病毒的临床检测及猪嵴病毒的遗传进化分析

为了解引起猪腹泻疫病的病毒性病原种类及感染现状,本研究首先针对7种报道较少但可引起猪腹泻的病毒性病原建立了多重RT-PCR检测方法,包括猪捷申病毒(PTV)、猪萨佩罗病毒(PSV)、猪丁型冠状病毒(PDCo V)、猪嵴病毒(PKV)、猪札幌病毒(PSa V)、猪星状病毒(PAst V)和猪环曲病毒(PTo V)。利用该方法对419份临床腹泻粪便样品进行筛检,结果显示PKV检出率最高,阳性率达26.98%–45.79%;PKV和其他病原混合感染率达9.52%–18.54%。基于PKV的高检出率及其可能在猪腹泻疾病中发挥的作用,本试验进一步选取3个PKV阳性样品进行全基因组序列测定及遗传进化分析。结果表明,这3个阳性样品PKV均归属于猪嵴病毒属,且与其他动物嵴病毒遗传距离较远,分别标记为CM-PKV、JS-PKV和PD-PKV;它们的全基因组同源性为88.1%–89.1%;CM-PKV与2013年报道的中国株JS-02a-CHN/2013同源性最高,而JS-PKV和PD-PKV则与2008年报道的匈牙利株K-30-HUN/2008/HUN同源性最高。表明上海不同地区猪群中存在的PKV有明显的遗传差异,但毒株遗传特性的差异与其致病力的相关性需进一步研究。本研究为深入了解PKV的流行现状及探讨其在猪腹泻疫情中的作用提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒的分离及间接ELISA的建立

本文在介绍猪流行性腹泻病毒的基础上,对猪流行性腹泻病毒的分离以及间接ELESA的建立进行了阐述,指出只有对这类病毒进行深入的了解和研究,才能科学有效的进行预防。     

口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了口蹄疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据口蹄疫病毒多聚蛋白基因保守区段设计的LAMP引物能够在65℃下,1 h内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断。该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪水泡病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒等无交叉反应,可检测到10-5稀释度的目标病毒核酸量,比普通RT-PCR的灵敏性高100倍,比荧光PCR高10倍。     

猪肠病毒G (EV-G)荧光定量PCR检测方法的建立与四川地区分子流行病学调查

【背景】猪肠病毒G (Enterovirus G,EV-G)在猪群中普遍存在,可引起猪的皮肤损伤、肌肉麻痹、肺炎、发热、腹泻等,也存在无症状感染。【目的】建立检测EV-G的荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)方法并开展四川地区分子流行病学调查。【方法】根据EV-G的5ʹUTR基因保守序列设计特异性引物,建立可检测EV-G各基因型的RT-qPCR,并评估其灵敏性、特异性和重复性,开展四川地区EV-G的流行调查。【结果】标准品在1.89×10²-1.89×10⁸ copies/μL浓度范围内线性关系良好;在特异性试验中,其他9种猪病毒(猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、日本乙型脑炎病毒、猪萨佩罗病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒)检测均为阴性;最低检测浓度为1.89×10¹ copies/μL;组内和组间变异系数分别小于1%和2%。检测2013-2021年四川省431份猪腹泻样品,EV-G总体阳性率为31.1%,表明该病毒在四川地区的感染较普遍。随机选取9份四川的EV-G阳性样品扩增VP1基因并测序分析,发现四川EV-G流行的基因型包括G1、G3、G4和G9,但以EV-G1为优势基因型。【结论】本研究建立了一种检测EV-G各基因型的RT-qPCR方法,并初步掌握了四川EV-G的流行现状,为后续深入开展该病毒的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和失水为特征的猪肠道传染病.各种年龄的猪都可发病[1],哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率最高可达100%,尤其哺乳仔猪的受害最严重.本病在欧洲许多国家均有报道.上海畜牧兽医研究所等单位证实,我国近年来发生的仔猪腹泻,有很多为PEDV引起.     

猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性

从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。     

基于宏病毒组学技术挖掘猪腹泻粪便的病毒群落组成

为系统鉴定现阶段上海地区仔猪腹泻样品中的病毒群落组成,本研究利用宏病毒组学技术对临床采集的猪腹泻粪便进行了宏病毒高通量测序。结果显示,测序获得了1,676,726个RNAcontig和95,111个DNAcontig,RNA病毒和DNA病毒序列分别占比38.58%和3.10%。其中星状病毒科、杯状病毒科和小RNA病毒科是病毒总群落中占比最高的前3个科。虽然DNA病毒在病毒总群落中的占比较低,但其单组分环状DNA (CRESS-DNA)病毒种类丰富多样,包含有18种CRESS-DNA病毒。经基因组序列深度拼接,共获得了46条病毒全基因组序列,包括2株猪星状病毒和3株类似星状病毒、2株札幌病毒、16株小双节RNA病毒和23株CRESS-DNA病毒。其中1株札幌病毒归属于GII/3亚型,与人札幌病毒亲缘性较近。16株小双节RNA病毒中有4株归属于GGI亚型,其余12株归属于GGII亚型。23株CRESS-DNA病毒中有1株归属于类双生病毒科、12株CRESS-DNA病毒归属于小环状DNA病毒科,另外10株CRESS-DNA病毒未分类。本研究揭示现阶段猪腹泻粪便中以RNA病毒为主导,且存在宿主...     

猪流行性腹泻病毒逃逸宿主天然免疫的研究进展

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种肠道α冠状病毒,靶向猪小肠上皮细胞,使得小肠上皮组织被破坏,肠道充血,肿胀,引起猪群水样腹泻,导致育肥猪厌食和体型消瘦。其中哺乳仔猪死亡率高。2010年后,随着新的PEDV变异毒株出现,PED再一次在全球暴发,特别是亚洲国家,造成了严重的经济损失。机体的先天免疫并不能完全抵抗PEDV对机体的侵害,因此了解PEDV通过影响干扰素(Interferon,IFN)的产生来逃逸先天性免疫的途径十分必要,同时也为治疗PEDV感染以及研发PEDV疫苗提供了思路。     

基于宏基因组学的猪群样本病毒探测方法的建立

极其多样的病毒广泛存在于我们周围的环境和动物体内,其中很多病毒是人类所未知的,而发现未知病毒常常受制于病毒常规检测技术的局限性.[目的]构建未知病毒检测技术平台.[方法]应用病毒宏基因组学的理念,结合新型分子诊断技术,首先利用过滤和核酸酶处理去除样品宿主核酸干扰,然后随机PCR扩增潜在的病毒宏基因组,最后通过大规模测序及序列分析获取病毒核酸信息.[结果]利用此技术我们对猪瘟病毒(CSFV)细胞培养物和猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪病料进行了分析,分别检测到序列总长度1680 bp,占基因组13.7％的CSFV序列和序列总长度834 bp,占基因组47.2％的PCV2序列;利用此检测技术平台研究一未知病原细胞培养物,通过测序和序列分析,结果显示56条序列中有26条为副流感病毒5型(PIV5)同源序列,覆盖了其基因组全长的16.4％;此外,应用本研究建立的方法结合新一代高通量测序,我们在混合的7份病原未知的病猪组织样品中检测到了1.1％的病毒序列,包括CSFV、PCV2、猪细环病毒(TTSuV)、猪bocavirus (PBoV)和人腺病毒6型(Ad6)等的部分基因序列.[结论]本研究建立的基于病毒宏基因组学的未知病毒的检测方法突破了传统病毒研究方法的缺陷,对于猪群样本中病毒的检测具有较高的敏感性,有望为新发、突发感染性疾病的诊断和监测提供技术支持.     

猪流行性腹泻病毒分子生物学特征

猪流行性腹泻 (ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ ,ＰＥＤ)是以水泻、呕吐和脱水为特征的一种急性病毒性腹泻。猪流行性腹泻现已成为世界范围内的猪病之一。猪流行性腹泻病毒 (Ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ ,ＰＥＤＶ)是ＰＥＤ的致病因子 ,是导致类似猪传染性胃肠炎 (ｐｏｒｃｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ,ＴＧＥ)临床症状的真正病原。迄今为止已发现ＰＥＤＶ与ＴＧＥＶ[1] 、ＰＥＤＶ与ＰＣＶ混合感染猪[2 ] 。已有用蛋黄ＩｇＹ预防ＰＥＤ效果的报道[3] …     

猪流行性腹泻病毒分子生物学特征

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是以水泻、呕吐和脱水为特征的一种急性病毒性腹泻.猪流行性腹泻现已成为世界范围内的猪病之一.猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是PED的致病因子,是导致类似猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis,TGE)临床症状的真正病原.迄今为止已发现PEDV与TGEV[1]、PEDV与PCV混合感染猪[2].已有用蛋黄IgY 预防PED效果的报道[3],还有用弱化的PEDV疫苗对仔猪进行免疫的报道[4],但都对其作用机制未作深入探讨.弄清PEDV的分子生物学特征,针对PED进行特异性免疫,必将对PED的诊断、治疗和综合防治产生深远影响.本文仅就PEDV的分子生物学特征作一综述.     

猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gas-troenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征[1]。猪传染性胃肠炎病毒隶属于冠状病毒科冠状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原,其基因组为单股正链的有感染性不分节段的RNA,TGEV结构蛋白主要由S、N、Ms、M蛋白组成[2]。其中n基因指导合成病毒的核衣壳蛋白(N),它是一种磷酸化的蛋白,存在于病毒粒子的内部,其分子质量为47kD[3],与病毒基因组组成核衣壳;N…     

型内嵌合口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆的构建

【目的】近年来,O型口蹄疫的不断暴发严重危害了我国畜牧业的发展,其病原——O型口蹄疫病毒已演化出3种谱系:中国型猪毒系、泛亚系和缅甸98系。其中中国型猪毒系病毒高度嗜猪,对养猪业危害最大。目前应用的疫苗已不能有效保护中国型猪毒系变异株的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,用流行的新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因(主要是替换VP1蛋白上的B-C环和G-H环)替换疫苗毒株的相应部分,构建了嵌合的FMDV全长cDNA克隆。【方法】线化的嵌合全长质粒和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,体内转录拯救嵌合病毒。【结果】嵌合全长质粒转染BHK-21细胞36h后,出现明显的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察结果证实成功拯救到嵌合的FMDV。拯救的病毒乳鼠致病性试验结果表明该拯救病毒对乳鼠的致病力减弱。该嵌合病毒的成功拯救为研制口蹄疫新型疫苗等奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒三型、猪流感病毒三重RT-PCR检测方法建立及初步应用

【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒三型(porcine circovirus type III,PCV3)和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原,对养猪业造成严重的经济损失,因此需要建立高效快速的检测方法,以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法,为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪圆环病毒三型(PCV3),猪流感病毒(SIV)基因序列,分别设计3对特异性引物,扩增PRRSV M和N基因(436bp)、PCV3 Cap基因(619bp)和SIV M基因(199bp)。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法,并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法,而对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type II,PCV2)、猪细小病毒2型(porcine parvovirus II,PPV2)、猪细小病毒3型(porcine parvovirus III,PPV3)和猪细环病毒1型(torque teno sus virus I,TTSuV1)等6种病原的扩增均为阴性,特异性较好。敏感性结果显示,同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL,批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测,结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%,而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,能够应用于临床样品检测,有效预测病原的流行情况。     

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用

为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。     

猪瘟病毒抗体纳米荧光检测试纸条方法建立及性能评价

基于镧系元素Eu微球标记技术建立了一种猪瘟病毒抗体检测的免疫层析方法。通过对反应体系中包被浓度、复溶浓度以及反应时间等因素进行优化,确定最适的反应条件,建立检测方法,然后通过从敏感性、特异性、重复性、临床评价等方面对其进行性能评价。对反应体系进行优化,最终确定包被浓度为0.1 mg/mL,复溶浓度为6倍稀释,检测时间为15 min。通过对试纸条的性能评价可以得出,猪瘟病毒抗体荧光检测试纸条的敏感性为猪瘟阳性血清国家参考品倍比稀释至1∶128倍仍可以检测到;对常见的猪繁殖与呼吸综合征、猪I型疱疹病毒、猪口蹄疫、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻、牛病毒性腹泻病毒、羊边界病毒等抗体阳性血清无交叉反应;批内和批内变异系数均小于10%;经临床评价,与商品化的猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒相比阳性符合率为90%,阴性符合率为100%,总符合率为97.7%;与荧光抗体中和试验(FVNT)的阴性符合率为100%,阳性符合率为93%,总符合率为98.5%。综合评定认为本研究建立的猪瘟病毒抗体纳米荧光检测方法,符合各项性能参数,可以快速、经济、方便地对猪个体及群体进行猪瘟病毒抗体检测评估,可广泛应用于猪场管理中。     

猪细小病毒分子生物学研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,研究发现该病毒在进化史上相对保守,对宿主专一性高,但近年来相继发现的PPV2和PPV香港株(Porcine HoKovirus,PHoV)与PPV差异较大,对PPV、PPV2和PHoV的基因组结构、分子进化研究、复制培养现状及其蛋白表达方面研究进行了简单综述,为猪细小病毒多样性研究提供参考。     

北京地区两种虫媒病毒的监测

1984年我们对北京地区的乙型脑炎病毒和M14病毒进行了监测,观察到三带喙库蚊季节消长高峰在8月中旬,较发病率较高的1980年和1981年晚3周左右:乙型脑炎病毒检出率(批)为16.1％,最低现场感染率为1:303,检出高峰在8月中旬(44.0％),较1981年晚2周以上;到8月初才发现所感染的猪,明显晚于1980年和1981年,受上述众因素的影响,本年度本市乙型脑炎发病率仍较低(0.8/10万),在M14病毒的监测中,发现三带喙库蚊环病毒M14病毒检出率为9.32％,最低现场感染率为1:526,当年最高检出率(32％)和最低现场感染率高峰(1:156),高峰出现在8月30日,与乙脑病毒自然感染率出现的高蜂相一致;猪感染M14病毒与感染乙脑病毒的时间基本相同,表明这两种病毒在自然界传播中不存在明显的互相干扰关系,乙脑低流行年的出现并未受到M14病毒的影响。     

牛病毒性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立

目的:建立牛病毒性腹泻病毒(BVDv)的环介导体外等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:根据BVDv的5'端非编码区序列,在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物(2对特异性引物和1对环引物),对反应条件和试剂浓度进行优化,建立恒温(63.5℃)、快速(65min)的检测方法。结果:建立的方法特异性好,检测其他对照病毒均为阴性;灵敏度高,最低可检测到1个拷贝的阳性质粒,可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。结论:建立了用于检测BVDv的LAMP方法,该方法简便、快速、特异性好、灵敏度高,适合基层和现场检测。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的RNA酶活性及其研究进展

猪瘟病毒（CSFV,Classicalswinefevervirus）属于黄病毒科瘟病毒属,同属的成员还有牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和羊的边界病病毒（BDV）。猪瘟病毒是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组大小约12．3kb,含有一个大的ORF,此ORF编码一个大的多聚蛋白,经宿主和病毒编码蛋白酶的共同作用,在共同翻译中和／或翻译后,将此多聚蛋白加工成病毒的结构蛋白和非结构蛋白．猪瘟病毒基因组的5＇端编码病毒结构蛋白,即衣壳蛋白（C）和三个囊膜糖蛋白（E0、E1、E2）。其中E0和E2能够刺激机体产生中和抗体,并使猪获得免疫力[1,2]．意外发…