埃博拉病毒包膜糖蛋白研究进展

埃博拉病毒可引起人类高致命性流行性出血热暴发,至今没有预防和治疗的疫苗和药物。作为埃博拉病毒包膜唯一的表面蛋白,包膜糖蛋白是一种多功能蛋白质,在病毒的吸附和穿入宿主细胞、致病性、下调宿主细胞表面蛋白质表达和增加病毒装配和出芽过程中起着至关重要的作用;同时包膜糖蛋白是保护性免疫的主要目标,是诱导产生中和抗体的最理想抗原。本文就近五年埃博拉病毒包膜糖蛋白的基因结构、致病机制和免疫原性方面的研究进展做简要回顾。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在昆虫细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV gE。在sf9昆虫细胞中鉴定序列优化前后表达量的差异,并在High FiveTM细胞中大量表达。通过Ni-NTA亲和层析方法得到高纯度gE蛋白,之后通过酶联免疫吸附试验等验证了其理化性质,并进行小鼠免疫分析其免疫原性。结果:构建了pFastbac-VZV g E1/2重组质粒,经过PCR及双酶切鉴定后均为阳性克隆。使用BAC/PAC试剂盒提取Bacmid转染sf9细胞制备杆状病毒,经Western blot检测,sf9细胞开始表达gE蛋白且随着病毒代次升高g E蛋白表达量增加。序列优化后表达量明显增加,但是大部分以胞内形式存在。通过Ni-NTA一步亲和层析获得纯度较高的gE蛋白,并与VZV单抗9C8具有较好的反应性。通过免疫小鼠产生高滴度抗体,且免疫荧光结果显示其血清可以与天然病毒上的gE抗原结合。结论:成功获得了杆状表达系统表达的gE蛋白并且纯化和鉴定了蛋白质的性质及免疫原性,为进一步研发具有自主产权的VZV亚单位疫苗研究奠定了基础。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白N的单克隆抗体制备及初步研究

水痘-带状疱疹病毒(VZV)是水痘和带状疱疹的共同致病原,其糖蛋白N(gN)在子代病毒的组装、成熟和出胞过程中发挥重要作用。但是目前关于VZV gN的研究还很少,其蛋白性质和具体分子功能仍不清楚。本研究目的是制备抗VZV gN的单克隆抗体,对该蛋白在VZV感染细胞和人皮肤组织内的表达和分布情况进行初步探究。本研究选择抗原性和亲水性较强的gN区段基因,构建rGST-gN融合蛋白的原核表达质粒,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌后用IPTG诱导融合蛋白表达,经亲和层析柱纯化rGST-gN融合蛋白后使用PSP酶切除GST标签,将获得的重组蛋白rgN免疫BALB/c小鼠,使用杂交瘤技术制备其单克隆抗体;共获得24株稳定分泌抗VZV gN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取其中一株性能最优的12E10进行单克隆抗体生产纯化和抗体鉴定;单克隆抗体12E10为IgG2a亚型,其ELISA效价达到1∶10 000;通过Western blot、免疫荧光及免疫组织化学染色方法鉴定,该抗体能够特异性识别细胞和组织中表达的VZV gN;本研究应用该抗体首次确定了gN在VZV感染细胞中的反式高尔基体定位,并且确定了gN在VZV感染人皮肤组织中的表达。以上工作为今后深入研究VZV gN功能奠定了基础。     

水痘-带状疱疹病毒的基因分型与分子进化

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)又称人类疱疹病毒3型,属疱疹病毒科,与单纯疱疹病毒HSV-1、HSV-2一起归入α亚科。人类是其唯一的自然宿主,对其普遍易感。VZV引起的原发感染表现为水痘,并在宿主的感觉神经节内潜伏,再激活时可引起带状疱疹。近年来VZV分子流行病学的研究涉及流行病学、病毒学、生物信息学等相关领域,通过监测、研究VZV的基因变异,区分疫苗株或野生株引起的感染,探讨世界范围内各VZV病毒株的系统发育关系和各遗传支之间的分子进化史。现将近年来有关VZV不同的地理分布和遗传支进化的研究状况综述如下。     

猪流感病毒概述

猪流感(Swine influenza,SI)是由甲型流感病毒引起的猪急性呼吸道传染病,不仅给养猪业带来了极大的危害,还严重危害人类健康,因此引起全球公共卫生的关注。猪对哺乳动物流感病毒和禽流感病毒都易感,被认为是二者之间进行基因重配和跨种传播的重要中间宿主,也是产生引起人类流感大流行毒株的重要来源。目前全球猪群中流行的流感病毒以H1N1、H3N2以及H1N2亚型为主,但各地流行的猪流感病毒(Swine influenza viruses,SIVs)谱系或基因节段的来源均有差异。北美地区近期暴发的猪流感三源重配H3N2/H1N2亚型变异株感染人的事件再次提醒我们要密切关注SIV对公共卫生的威胁。因此,监测和研究甲型流感病毒在全球猪群中的流行动态对于大流行应对是非常重要的。     

中国流行性乙型脑炎病毒表型和基因型的研究进展

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒是引起病毒性脑炎最主要的病毒之一,本文对我国分离株的表型和基因型特性进行了综合分析。生物学特征研究显示,不同毒株间存在空斑形态、小鼠神经侵入致病性、保护性抗原和血凝性的明显差异。中国在1977年前,自然界中仅存在基因Ⅲ型乙脑病毒,但自1977年以后基因Ⅰ型和Ⅲ型病毒均从自然界分离到,而基因Ⅰ型病毒已成为优势病毒,其中多数分离自蚊虫。基因序列分析显示,两种基因型的氨基酸序列差异率很小(≤3%),与当前广泛应用的减毒活疫苗株比较,仅≤3%的氨基酸序列差异率,这些差别主要存在于与SA14-14-2减毒相关的位点,提示SA14-14-2疫苗能够有效地保护这两种基因型毒株的感染。     

7例水痘患者水痘带状疱疹病毒的分离与鉴定分析

目的对7例临床水痘患者的疱疹液样本,进行水痘带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV)的分离及鉴定分析。方法对7例临床水痘患者的疱疹液,用2BS细胞进行病毒分离及病毒滴度检测;用特异性引物分别对病毒分离株及疫苗株(Oka株)的ORF68、ORF54、ORF38进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增及测序,用DNAMAN软件对病毒分离株的ORF68序列与Dumas株序列进行比对鉴定,并对病毒分离株和Oka株的ORF54、ORF38进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。结果从7例临床水痘患者的疱疹液样本中,分离到4株VZV病毒株;病毒分离株的细胞病变(cytopathic effect,CPE)及病毒滴度随传代次数的增加而增强;4株病毒分离株的ORF68序列与Dumas株完全一致;ORF54、ORF38的RFLP结果显示,4株病毒分离株均为BglⅠ+PstⅠ+型,Oka株为BglⅠ+PstⅠ-型。结论成功分离的4株病毒分离株均为VZV野生毒株。     

白蛉病毒属研究进展

白蛉病毒属病毒是单股负链RNA病毒,隶属布尼亚病毒科,基因组分为L、M和S三个片段,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、包膜糖蛋白和核蛋白。白蛉病毒是虫媒病毒,主要通过节肢动物传播,迄今为止,文献报道的白蛉病毒已有70多种,68个已知病毒种被分为白蛉热病毒组和乌库病毒组,其中某些白蛉热病毒组成员与人类疾病密切相关,而且最近又有新型白蛉病毒出现,本文就白蛉病毒属的分子特征、流行病学、诊断、治疗及新发现的白蛉病毒的概况展开综述。     

禽流感病毒样颗粒研究进展

病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是指由病毒一个或几个结构蛋白自行组装成不含病毒基因组且不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。VLPs因能够模拟天然病毒的构象表位而保持了完整病毒颗粒所具有的免疫原性,可诱导机体产生广泛强大的抗病毒免疫反应,阻止病毒侵入机体,在抗病毒性疾病的预防或治疗性疫苗及诊断试剂的研究开发方面具有巨大的应用前景。本文就禽流感病毒样颗粒相关研究进展进行综述,以期为我国禽流感VLPs的研究提供参考。     

狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析

对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。     

H7亚型禽流感病毒概述

自2002年以来,全球报道的人感染H7亚型禽流感病毒病例超过100人,波及荷兰、意大利、加拿大、美国以及英国等国家。人感染H7亚型禽流感病毒的临床表现由结膜炎至轻微的上呼吸道疾病,甚至是肺炎。2013年3月31日,中国报道了上海市和安徽省两地共3例H7N9亚型禽流感病毒(AIVs)感染死亡病例。由于从家禽中分离到的H7亚型流感病毒不断增加,而且H7亚型AIVs感染人所导致的严重的临床症状,因此该亚型流感病毒对人类健康造成严重威胁,所以我们必须提高对H7亚型AIVs的认识,并要加强人群和动物中流感病毒的持续监测以及疫苗和药物的研究,以应对可能由于H7亚型AIVs引起的流感大流行。     

2010年云南省1株ECHO-9病毒全基因序列的遗传特性分析

为了解云南省手足口病患者标本中分离到的一株ECHO-9病毒基因组特征,对2010年云南省ECHO-9病毒分离株MSH-KM812-2010全基因组序列测序,并与GenBank中其它ECHO-9病毒株基因组序列比对和分析。MSH-KM812-2010基因组长为7 424bp,编码2 203个氨基酸,其结构基因区与其它ECHO-9病毒核苷酸和氨基酸的同源性高于其它型别肠道病毒;而在非结构区,与其它肠道病毒血清型的同源性高于ECHO-9病毒株。VP1系统进化分析显示ECHO-9病毒株可形成A、B和C三个进化分支,MSH-KM812-2010株以及其它中国分离株属于C簇。三个分支之间核苷酸序列的差异大于15.0%可将ECHO-9病毒分为三个基因型。通过重组检测软件3(RDP3)和基本局部比对搜索工具(BLAST)比对分析,发现在非结构区可能存在重组。本文首次对我国分离的ECHO-9病毒全基因组序列的测定和分析,对了解ECHO-9病毒遗传特性具有重要意义。     

北京地区急性呼吸道感染儿童中人鼻病毒感染状况研究

为了解北京地区急性呼吸道感染儿童中人鼻病毒(HRV)-A、B、C型(尤其是HRV-C)的感染状况及分子生物学特征,本研究收集了2011年1月至12月急性呼吸道感染患儿呼吸道标本703例,采用半巢式PCR方法同时进行HRV-A、B、C检测,并对HRV阳性标本进行VP4/VP2衣壳蛋白编码区基因序列测定及进化树分析。结果显示703例标本中共有54例HRV检测阳性,总阳性检出率为7.7%(54/703);HRV感染的儿童中年龄在5岁以下的占94.4%(51/54);HRV检出率在毛细支气管炎患儿中最高(23.1%),其次是哮喘(20.0%)、肺炎(11.0%)、急性支气管炎(4.3%)、急性上呼吸道感染(4.1%)患儿;序列分析表明54例HRV检测阳性标本中25例为HRV-A(46.3%,25/54),8例为HRV-B(14.8%,8/54),21例为HRV-C(38.9%,21/54);HRV同一基因型内各核苷酸序列同源性为70.0%～100.0%,不同基因型间核苷酸序列同源性为55.5%～65.8%。上述结果提示,HRV是引起北京地区儿童急性呼吸道感染(尤其是下呼吸道感染)重要的病毒病原之一;HRV-C阳性检出率与HRV-A相近,较HRV-B高;HRV各个基因型间具有较高变异性。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株和84-7株基因特征的分析

目的对水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株和84-7株的部分基因特征进行分析,为建立Oka株和84-7株的鉴别方法提供依据。方法利用PCR技术扩增相关基因,并运用生物信息学软件对水痘-带状疱疹病毒OKa株和84-7株的Pst I酶切位点、抗原蛋白基因序列(ORF14,ORF68)、高突变区域(ORF62)及84-7株复制起点进行序列比较和分析。结果 Oka株酶切位点特征为Pst I-Sma I~+Bss HII~+Nae I~+,84-7株的酶切位点特征为Pst I~+Sma I~-Bss HII~-Nae I~-;Oka株和84-7株ORF14编码的蛋白质同源性为99.8%,3个碱基的差异导致了3个氨基酸的变化,且这两株病毒株的R2可变区的串联重复单位拷贝数均为7;Oka株和84-7株ORF68编码的蛋白质同源性为100%,且存在2个低复杂性区域(LCR);ORF62编码区蛋白质的同源性为99.2%,具有14个低复杂性区域;84-7株复制起点区域包含一个13TA+19GA结构。结论 Oka株和84-7株的同源性很高,但在酶切位点方面存在差异,可用于Oka株和84-7株的鉴别,为今后确立水痘-带状疱疹病毒毒株的鉴别方法提供依据。     

去N端信号肽的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的原核可溶性表达及其免疫原性评价

水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,gE)是VZV亚单位疫苗的主要候选蛋白,但目前原核表达系统制备的gE蛋白以包涵体形式为主,可溶性差。本研究采用去除第1～30氨基酸序列的VZV gE胞外域基因,将其与原核表达载体pET32a连接,并转化至感受态细胞BL21(DE3)中。使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,His-tag柱纯化重组gE蛋白,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其特异性。用该重组gE蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光法检测多克隆抗体效价及特异性。结果显示,BL21/pET32a-VZV gE工程菌可以表达可溶性重组gE蛋白,纯化后纯度约为90%。WB鉴定该重组蛋白具有良好的免疫反应性。ELISA检测显示小鼠抗VZV gE多克隆抗体效价＞1∶10 000,间接免疫荧光实验结果显示该抗体特异性较高。结果表明,本研究在原核表达系统中成功表达可溶性重组VZV gE蛋白,同时该蛋白具有较强的免疫原性,这为VZV gE亚单位疫苗的研制和大规模生产奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒YB株σB蛋白的基因序列分析及其原核表达

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,DRV)是造成雏番鸭高死亡率的重要病原体,深入其检测与免疫研究对于防控DRV感染意义重大。利用RT-PCR和测序技术,对3株福建DRV分离株的S3基因进行序列分析,发现DRV-YH、YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)遗传距离较近,同源性高达94.6%～98.9%,而DRV-YB株与ARV同源性仅为60.6%～61.7%。构建和鉴定DRV YB株重组原核表达质粒pET-30a-S3,并转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE表明,表达的目的蛋白分子量约为42ku,IPTG最适诱导浓度为0.1mM,最适诱导时间为5h,最适诱导温度为37℃,以包涵体形式存在。薄层扫描显示重组DRVσB蛋白占菌体总量的67.7%。以Ni 2+柱亲和层析纯化蛋白,纯化后的目的蛋白纯度为93%,质量浓度为0.86g/L。Western blot分析该融合蛋白能与抗DRV阳性血清发生特异性反应,表明重组DRVσB蛋白具有良好的免疫反应性。     

圆环病毒Cap基因及其编码的衣壳蛋白研究进展

圆环病毒负义链上的Cap基因是基因组中变化最大的基因,其编码病毒的衣壳蛋白,具有良好的免疫原性,N端的核定位信号与病毒的定位有关。本文对圆环病毒Cap基因的序列特点、编码衣壳蛋白氨基酸序列的特点、基本功能、在病毒复制、运输中的作用以及与MKRN1蛋白、热激蛋白Hsp40、受体蛋白gC1qR、补体因子C1qB的相互作用进行了总结,旨在阐明衣壳蛋白在病毒吸附、复制以及运输中发挥着重要作用,为今后深入研究提供重要的理论依据。     

呼吸道病毒多病原检测技术研究进展

呼吸道病毒感染是导致人群发病和死亡的主要原因之一。通过多重病原检测迅速筛查大量致病原,已成为呼吸道病毒感染检测的重要技术。本文介绍了呼吸道病毒多病原检测技术及一些对呼吸道病毒检测有潜在应用价值的新兴技术。这些技术包括多重呼吸道病毒快速分离培养技术、传统多重逆转录PCR技术、多重实时定量PCR技术、微芯片技术、质谱技术及宏基因组技术等。这些技术的发展和应用,不但有助于提高呼吸道病毒感染的快速诊断和治疗,而且也将促进新型呼吸道病毒的发现。     

2011年甘肃地区急性呼吸道感染儿童患者中鼻病毒感染规律的研究

探讨人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV)在甘肃地区急性呼吸道感染儿童患者中的流行特征。2011年1月至12月,从甘肃地区急性呼吸道感染儿童患者中采集咽拭子标本286份,用多重PCR方法对常见呼吸道病毒性病原体进行筛查。多重PCR结果中HRV阳性的标本再用nested-PCR分别扩增HRV的VP1和VP4/VP2结合区基因片段,阳性结果进行序列测定和基因分析。286份咽拭子标本中,27份标本多重PCR检测结果显示为HRV阳性,检出率为9.44%。本研究中,HRV感染病例的平均年龄为3岁,其中,1岁以内儿童感染比例最高,占总阳性数的44.4%(12/27);在27例HRV阳性病例中,男性占16例(16/185,8.64%),女性占11例(11/101,10.89%),两者无显著性差异;HRV感染的高峰出现在5月份(6/27,22.2%);从HRV感染的疾病构成看,普通感冒的比例最高,占12.24%(12/98);其次为肺炎,占8.50%(13/153);剩余2病例均为支气管炎。基因序列特征分析发现:A组HRV是甘肃地区2011年的优势流行基因型,占阳性病例的84.62%(22/26),其次为C组HRV,占11.54%(3/26),B组HRV仅发现1例。HRV感染在2011年甘肃地区全年均可发生,主要感染以1岁以内儿童。A组HRV是该地区2011年急性呼吸道感染儿童患者中的主要流行基因型,并存在多个基因型和多个HRV血清型共同流行的特点。