猴腺病毒研究进展

猴腺病毒（simian adenovirus,SAdV）是猴类呼吸道和消化道的常在病毒之一,可引起肺炎、咽炎、肠胃炎、结膜炎等以粪口途径传播为主,主要感染猕猴、非洲绿猴、黑猩猩和狒狒等[1]属腺病毒科,哺乳动物腺病毒属。有学者认为SAdV感染有严格的种属特异性,也有报道认为其种间交叉传播在非人灵长类中可能普遍发生,是动物传染病似的感染。SAdV是否感染人类尚未见报道,但已从猴的分泌物中发现了可能和人腺病毒（humanadenovirus,HAdV）发生重组的新型腺病毒。SAdV与HAdV亲缘关系很近,感染引起的临床症状也相似,是人腺病毒研究的理想模型。目前已经制定了研发猴腺病毒模型的目标,用于研究感染机制,促进腺病毒基因治疗和疫苗开发进程[3]。但猴腺病毒自然感染流行情况的研究依然很少。本文将就SAdV的发现与分类、生物学特性、感染特点及检测方法做一综述,为研究者提供一些有用参考。     

北京地区人群腺病毒感染情况的研究

目前已知人类腺病毒有34个血清型,广泛分布在世界各地,其中有10个血清型(1—7、11、14、21型)与人类呼吸道疾患有关。但世界各地感染的病毒型别不完全一样,英国、美国以1、2、6型为主,日本、苏联以3型为主。1958年在北京、长春等地流行的婴幼儿腺病毒肺炎即由腺病毒3、7型引起的。以后又在其他一些城市陆续出现类似病例。1964年后又发现11型腺病毒同样是婴幼儿腺病毒肺炎的一个重要病原。在六十年代初我国曾对腺病毒的流行情况及人群抗体水平进行过调     

辽宁省首次从急性弛缓性麻痹(AFP)病例分离的一株人腺病毒1型重组株的全基因组序列特征分析

人腺病毒(Humanmastadenoviruses,HAdV)是一种常见的病毒病原体,在儿科患者中普遍存在.本研究首次报道了 2017年从辽宁省急性弛缓性麻痹(AFP)病例的粪便标本中分离到的一株人腺病毒1型重组株LN2017,并对其全基因组进行测序和分析.我们首先测定了 LN2017的全基因组序列,并将其与从GenBank数据库中下载的来自8个国家的38个参考株一起,构建了基于全基因组、Hexon基因,Penton base基因,Fiber基因和E3基因的系统发育树,并用RDP4.97和SimPlot3.5.1软件进行了重组分析.结果显示,LN2017病毒为HAdV-C亚属,其Hexon,Penton base和Fiber基因与HAdV-1高度相似,但是其E3基因和HAdV-2、HAdV-6高度相似.重组分析显示毒株LN2017是一个重组病毒,在E3基因区域和HAdV-2发生了重组,重组区域位于28045-31042.本研究首次证实了LN2017与 GenBank 中的 JX173080(埃及株 E13)、MH183293(上海株 SH2016)和 MH121110(德国株43C1)具有相同的重组方式,在HAdV-1内构成一个独立的分支.未来,有必要对该分支人腺病毒1型重组株的致病性和临床特征进行进一步研究,并继续加强对HAdV的分子流行病学监测.     

8型腺相关病毒载体的特性及其在基因治疗中的应用

腺病毒相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是最受关注的病毒载体之一。近年来从人类和灵长类动物中已发现100多个AAV病毒的血清型或变种。AAV血清型或变种的不断发现使AAV载体具有了更广阔的应用范围。在各种AAV载体中,8型腺相关病毒(AAV8)因在肝脏等组织显示了高效稳定的基因转染而受到极大关注。     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

一种改进的重组腺病毒载体的包装和克隆纯化方法

目的:重组腺病毒载体是目前使用最多的病毒载体之一。常用的AdEasyTM包装系统在制备条件复制型腺病毒时易混有野生型腺病毒或可复制型腺病毒(RCA),在HEK293细胞中包装出的重组腺病毒必须经过2～3轮噬斑的筛选,费时费力。本实验拟对常规包装方法进行改进。方法:将腺病毒载体质粒转染至HEK293细胞过程中的液体培养基更换为琼脂糖凝胶的混合培养液,因为凝胶形成的阻碍,包装出的病毒不能通过细胞-培养液-细胞的方式进行扩散,只能依靠细胞-细胞的方式来扩展而形成病灶(噬斑);然后随机挑选单个噬斑进行PCR鉴定,筛选出特异的目标病毒。结果:采用常规方法在HEK293细胞中初包装出的腺病毒,同源重组产生的RCA已被检测到。采用改进方法制备的重组腺病毒,能排除背景病毒的干扰,使重组腺病毒载体的包装和克隆纯化一步完成;利用此病毒初步在体外实现了对人肝癌细胞的特异性杀伤。结论:改进的方法是一种高效、简便、快捷地包装并纯化重组溶瘤腺病毒的方法,采用该方法包装的重组溶瘤腺病毒能满足实验的需要。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因.本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013 7/mL.用RT-PCR、间接ELISA、Western blot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达.该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验

构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估

研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定,证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒,并检测免疫后第14,28,42,56,70,84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示,犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组,滴度最高达2-8。研究表明,正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性,诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平,为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。     

共表达甲型流感病毒M1和HA双基因的重组腺病毒的构建及鉴定

以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建共表达H5N1亚型禽流感病毒膜蛋白基因M1和HA的重组腺病毒。PCR扩增禽流感病毒H5N1亚型M1和HA基因的全长可读框片段,先后亚克隆入pStar载体,然后扩增M1-IRES-HA片段并将其插入穿梭载体pShuttle-CMV,再与pAd-Easy载体在BJ5183菌中通过同源重组产生重组腺病毒载体,转化293细胞,包装出重组腺病毒Ad-M1/HA。将Ad-M1/HA感染293细胞,可观察到明显细胞病变效应,用免疫荧光及Western-blot方法均检测到M1和HA基因的表达。共表达M1和HA双基因的重组腺病毒的成功构建为开发新型重组腺病毒流感疫苗奠定了基础。     

人腺病毒流行病学研究进展

人腺病毒(Human adenovirus,HAdV)是引起儿童急性呼吸道感染(ARTIs)的主要原因之一,可引起重症肺炎的暴发流行,迄今为止尚无安全有效的防治手段.HAdV已有52个血清型,被分为7组,即HAdV A-G.有研究提示不同的型别导致的疾病严重程度不同,不同时间和地区的优势型别也有所差异.近年来,不断有新的HAdV型别被发现,已报道的共有103个型别.HAdV不断地以重组等方式进化,导致了组织嗜性和中和特性的改变,从而产生高致病性、高传染性的新型毒株,对疾病防控提出了新的挑战.本文以已有研究结果为基础,综合对HAdV的流行病学特征进行综述,为HAdV的疫苗研制和疾病防控提供参考依据.     

禽腺病毒QU株一个复制非必需区的鉴定

禽腺病毒QU弱毒株属于鸭腺病毒1型病毒, 可作为潜在的重组疫苗载体。为确定QU株的复制非必需区, 参照鸭腺病毒1型病毒基因组右侧E4区附近序列设计引物, 扩增QU株基因组的一段3.4 kb片段, 插入来自pEGFP-C1质粒的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒片段, 构建了含EGFP基因的重组质粒pADGFP。采用脂质体介导法, 将重组质粒pADGFP与QU株共转染CEF细胞, 用96孔板稀释法筛选纯化表达绿色荧光蛋白的重组QU病毒株rQUGFP。该重组毒的生长曲线与亲本毒一致, 连续传代后病毒滴度稳定。结果表明, QU株基因组右侧E4区附近一段包括ORF1、ORF8和ORF9三个开放阅读框的区域为病毒的复制非必需区, 且插入的EGFP基因可以稳定表达。为进一步以禽腺病毒QU株为载体构建重组疫苗的研究打下基础。     

一种高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体的构建

人C组5型腺病毒(Ad5)载体能够有效感染上皮来源的细胞,但对造血细胞的感染效率很低,限制了其在造血调控基础研究以及血液病基因治疗中的应用。为了建立高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体系统,对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造,以AdEasy系统为基础,应用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因,采用一系列分子生物学方法将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因,得到新的腺病毒骨架质粒命名为pAdEasy-1/F11p,应用带有GFP报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得重组腺病毒,命名为Ad5F11p-GFP。以Ad5-GFP作对照,同时感染K562、U937等白血病细胞系,流式细胞仪检测GFP的表达。初步检测结果显示:在10MOI时,Ad5F11p-GFP能够有效感染K562、U937等白血病细胞系,感染细胞效率>90%,对照Ad5-GFP感染细胞效率<30%,这表明改建后的腺病毒AdEasy-1/F11p可以高效介导基因转移到血液细胞,是一种很好的血液细胞靶向性腺病毒载体。     

荧光素酶标记的重组人3型腺病毒的构建及分析

人3型腺病毒在人DSG2受体转基因鼠体内复制及侵染等生命过程尚不清楚。本研究旨在构建含萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)报告基因的复制型重组人3型腺病毒,为可视化重组人3型腺病毒的应用奠定基础。通过PCR扩增萤火虫荧光素酶报告基因,克隆入去掉EGFP基因的人3型腺病毒穿梭质粒pSKA3E3LR(EGFP),经双酶切后与人3型腺病毒骨架质粒pBRAd3-EGFP的PCR扩增片段经重组酶Exnase体外重组的方法,得到中间载体,最后与pBRAd3-EGFP酶切片段连接,得到重组腺病毒质粒pAd3-LUC;转染AD293细胞,将包装成功的重组腺病毒rAd3-LUC纯化并免疫动物,分析重组腺病毒的特性和在小鼠体内的免疫反应。结果显示采用体外重组、酶切连接等方法成功获得到重组人3型腺病毒质粒pAd3-LUC,线性化的pAd3-LUC转染AD293细胞包装拯救得到重组腺病毒rAd3-LUC,观察到细胞病变和检测到荧光素酶的稳定表达,rAd3-LUC免疫小鼠抗血清可以识别并中和重组腺病毒rAd3-LUC(滴度约128～256)。本研究成功构建了E3区缺失并嵌入荧光素酶的复制型重组人3型腺病毒rAd3-LUC,为监控人3型腺病毒在人DSG2受体转基因小鼠体内复制及侵染等生命过程奠定基础。     

一种高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体的构建

人C组5型腺病毒(Ad5)载体能够有效感染上皮来源的细胞,但对造血细胞的感染效率很低,限制了其在造血调控基础研究以及血液病基因治疗中的应用.为了建立高效感染血液细胞的新型靶向性腺病毒载体系统,对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造,以AdEasy系统为基础,应用递归PCR的方法人工合成人B组11p型腺病毒的部分纤维(fiber)基因,采用一系列分子生物学方法将其替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因,得到新的腺病毒骨架质粒命名为pAdEasy-1/F11p,应用带有GFP报告基因的穿梭质粒pShuttle-GFP与AdEasy-1/F11p腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得重组腺病毒,命名为Ad5F11p-GFP.以Ad5-GFP作对照,同时感染K562、U937等白血病细胞系,流式细胞仪检测GFP的表达.初步检测结果显示在10MOI时,Ad5F11p-GFP能够有效感染K562、U937等白血病细胞系,感染细胞效率＞90%,对照Ad5-GFP感染细胞效率＜30%,这表明改建后的腺病毒AdEasy-1/F11p可以高效介导基因转移到血液细胞,是一种很好的血液细胞靶向性腺病毒载体.     

人Sef基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

构建人Sef-L和Sef-S基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 为研究Sef的功能和作用机制以及Sef的基因治疗奠定基础。通过PCR方法以hSef的表达质粒为模板扩增得到hSef的编码序列, 亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中, 经测序验证之后, 将穿梭载体使用Pme I酶切线性化, 然后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183, 得到重组的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒, 最后将Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒使用Pac I线性化, 转染到HEK293细胞中, 包装收获病毒颗粒, 免疫印迹实验鉴定表达, 荧光素酶报告实验验证其功能。成功构建了人Sef基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 获得了有功能的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S病毒重组子。     

人Sef基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

构建人Sef-L和Sef-S基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 为研究Sef的功能和作用机制以及Sef的基因治疗奠定基础。通过PCR方法以hSef的表达质粒为模板扩增得到hSef的编码序列, 亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中, 经测序验证之后, 将穿梭载体使用Pme I酶切线性化, 然后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183, 得到重组的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒, 最后将Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒使用Pac I线性化, 转染到HEK293细胞中, 包装收获病毒颗粒, 免疫印迹实验鉴定表达, 荧光素酶报告实验验证其功能。成功构建了人Sef基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 获得了有功能的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S病毒重组子。     

表达人γ-干扰素的重组腺病毒的制备及检测

El区缺失的腺病毒载体插入人γ-干扰素cDNA序列．与pJM17质粒通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞．经同源重组．共获得6个病毒噬斑。经PCR共扩增检测．证实这6个噬斑均为带有人γ-干扰素cDNA的重组腺病毒;受其感染的293细胞的上清中,都能洲到γ-干扰素的活性,且这种活性可被一定稀释度的兔抗人γ-干扰素多克隆抗体所中和。其中的1号重组病毒纯化后,接不同的M()I(Multiple of infection)值感染复制缺陷型腺病毒不能在其中增殖的B16F10细胞,未出现细胞病变效应(cytopalhic effect,CPE)．而上清中的γ-干扰素活性却随M()I值增大而升高,这证实构建的复制缺陷型腺病毒是能表达井分泌人γ-干扰素的。     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人 血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M。RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表 达M基因的mRNA和M蛋白。纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8 TCID50／ mL。动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd-M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应 答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础。