水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白由基因组片段S10编码。从RRSV福建沙县分离物(RRSV-F)中获取该病毒的全基因组,根据RRSV泰国分离物核苷酸序列设计特异性引物获得S10编码区,利用Directional TOPO克隆技术,将S10连接至克隆表达载体pET100/D-TOPO构建重组质粒,并进行了序列测定和分析。重组质粒经IPTG诱导在BL21star(DE3)E.coli中高效表达约35 kD Pns10蛋白。将Pns10蛋白免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1∶7 680,Western blot分析表明抗血清特异性强。表达产物及抗血清在Pns10蛋白的结构和功能研究中具有重要的应用价值,制备的抗血清可用于水稻病株和传播介体的检测以及病毒病的诊断。     

去N端信号肽的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的原核可溶性表达及其免疫原性评价

水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,gE)是VZV亚单位疫苗的主要候选蛋白,但目前原核表达系统制备的gE蛋白以包涵体形式为主,可溶性差。本研究采用去除第1～30氨基酸序列的VZV gE胞外域基因,将其与原核表达载体pET32a连接,并转化至感受态细胞BL21(DE3)中。使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,His-tag柱纯化重组gE蛋白,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其特异性。用该重组gE蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光法检测多克隆抗体效价及特异性。结果显示,BL21/pET32a-VZV gE工程菌可以表达可溶性重组gE蛋白,纯化后纯度约为90%。WB鉴定该重组蛋白具有良好的免疫反应性。ELISA检测显示小鼠抗VZV gE多克隆抗体效价＞1∶10 000,间接免疫荧光实验结果显示该抗体特异性较高。结果表明,本研究在原核表达系统中成功表达可溶性重组VZV gE蛋白,同时该蛋白具有较强的免疫原性,这为VZV gE亚单位疫苗的研制和大规模生产奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30-gp90串联表达蛋白及其免疫原性

【目的】研究禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus,REV)群特异性抗原P30与囊膜糖蛋白gp90体外共表达蛋白的免疫原性,为研发新型REV抗体诊断试剂盒提供基础。【方法】根据REV脾脏坏死病毒(spleen necrosis virus,SNV)株的前病毒基因组cDNA序列,设计合成2对引物,以pPB101质粒为模板,分别扩增REV p30基因和gp90基因片段。将PCR产物依次克隆入表达载体pET-28a(+)中,通过酶切鉴定和测序分析,筛选阳性重组克隆pET-p30-gp90。重组菌经异丙基硫代D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western blot检测表达蛋白与特异性血清之间的反应性。制备表达蛋白的抗血清,以该抗血清与REV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光实验(IFA),验证表达蛋白的免疫原性。【结果】经SDS-PAGE电泳后能观察到预期大小的表达条带,Western blot结果显示,重组蛋白能与REV抗血清反应。将表达产物纯化后免疫Balb/c小鼠,制备p30-gp90抗血清,该抗血清与REV感染CEF在IFA中呈现特异性荧光反应。【结论】体外串联表达REV p30-gp90蛋白,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30-gp90串联表达蛋白及其免疫原性

摘要:【目的】研究禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus,REV)群特异性抗原P30与囊膜糖蛋白gp90体外共表达蛋白的免疫原性,为研发新型REV 抗体诊断试剂盒提供基础。【方法】根据REV脾脏坏死病毒(spleen necrosis virus,SNV)株的前病毒基因组cDNA序列,设计合成2对引物,以pPB101质粒为模板,分别扩增REV p30基因和gp90基因片段。将PCR产物依次克隆入表达载体pET-28a(+)中,通过酶切鉴定和测序分析,筛选阳性重组克隆pET-p30-gp90。重组菌经异丙基硫代D-半乳糖苷( IPTG)诱导后,通过SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western blot检测表达蛋白与特异性血清之间的反应性。制备表达蛋白的抗血清,以该抗血清与REV感染的鸡胚成纤维细胞( CEF)进行间接免疫荧光实验(IFA),验证表达蛋白的免疫原性。【结果】经SDS-PAGE电泳后能观察到预期大小的表达条带,Western blot结果显示,重组蛋白能与REV抗血清反应。将表达产物纯化后免疫Balb/c小鼠,制备p30-gp90抗血清,该抗血清与REV感染CEF在IFA中呈现特异性荧光反应。【结论】体外串联表达REV p30-gp90蛋白,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

香蕉条斑病毒云南河口分离物开放阅读框Ⅱ的原核表达、融合蛋白纯化及抗血清制备

以课题组保存的连接在pMD-18T载体上的香蕉条斑病毒河口分离物全基因组为模板,设计一对特异引物,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与pET32(b)载体共同双酶切及T4连接酶连接,得到重组载体pET32-ORF2。将获得的重组质粒pET32-ORF2转化表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞,得到表达BSV的ORFⅡ的工程菌。经0.1mmol/L的IPTG诱导表达,超声波破碎后,获得的融合蛋白大多为包含体,但仍有少部分为可溶性蛋白可以进行后续的纯化步骤。将上述可溶性融合蛋白通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,获得纯度较高的融合蛋白。以纯化蛋白作为抗原免疫家兔,得到特异性抗血清。间接ELISA以及western blotting表明,所得抗血清效价和特异性都较高,可以用于检测。为BSV的快速检测以及一些相关后续理论研究工作奠定了一定基础。     

猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204 800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。     

尼帕病毒F糖蛋白在重组牛痘病毒中的表达及鉴定

尼帕病毒(NiV)F蛋白在病毒侵入细胞和诱导中和抗体等方面具有重要作用。通过over-lapping PCR合成密码子优化的F蛋白基因构建了表达NiV F蛋白的重组牛痘病毒(WR株)rWR-NiV-F。利用兔抗NiV血清为检测抗体,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了F蛋白在重组病毒感染细胞中的表达。SDS-PAGE和Western blot检测证明重组蛋白F0被裂解为F1和F2。以rWR-NiV-F感染瞬时转染共表达NiV受体结合囊膜糖蛋白G的BHK细胞,可诱导细胞膜融合及合包体形成,证明该重组病毒表达F蛋白保持良好的抗原性及生物学活性,为NiV诊断及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。     

中华大蟾蜍重组Gal-3C的原核表达、纯化及抗血清制备

半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)与肿瘤的发生发展密切相关,已有文献表明其羧基端galectin-3C(Gal-3C)具有一定的肿瘤抑制作用。为了获得Gal-3C的抗血清,实验以已有的重组质粒pGM-Gal-3为模板,利用PCR方法扩增中华大蟾蜍Gal-3C基因片段,并将其插入到表达载体pET28b上,构建中华大蟾蜍Gal-3C的原核表达载体pET28b-Gal-3C;将构建好的重组质粒pET28b-Gal-3C转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白Gal-3C的表达;以纯化的重组蛋白Gal-3C免疫小白鼠,制备鼠抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清,用Western-blot检测抗血清的特异性及其效价。结果显示成功构建了中华大蟾蜍pET28b-Gal-3C重组质粒,并诱导得到了目的蛋白的表达,而且将表达产物免疫小鼠后获得了特异性良好的抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清。以上结果为抗肿瘤药物的研究和发展奠定了基础。     

北京地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达

为了解北京地区流行的人呼吸道合胞病毒(HRSV)N蛋白基因的特征,并用大肠杆菌表达获得N蛋白,从2006年1月至3月收集的首都儿科研究所附属儿童医院急性呼吸道感染患儿标本中分离到7株HRSV毒株(3株A亚型,4株B亚型),分别经RT-PCR扩增得到HRSV N蛋白全基因,克隆至pUCm-T载体中并进行测序和分析;从重组质粒pUCm-N9968中经PCR扩增获得N基因,亚克隆入原核表达载体pET30a( )中,得到重组表达质粒pET30a-N9968,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导培养;SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和抗原性。经扩增并测序,7株HRSV N蛋白基因全长均为1 176 bp,编码一个含391个氨基酸的蛋白;北京地区7株RSV分离株的N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在85.4%~99.7%之间和95.4%~100%之间,进一步证明N蛋白基因的高度保守性。经诱导培养产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白,主要以包涵体形式存在。N蛋白粗提物经Ni2 亲和层析获得较理想纯化。Western blot结果显示,所表达的蛋白能与特异性单克隆抗体和人血清反应。说明本研究构建的重组pET30a-N9968原核表达质粒使N蛋白获得了高效表达,并且具有特异的抗原活性,为今后进一步研究奠定了基础。     

A组人轮状病毒NSP3基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得轮状病毒NSP3基因的表达产物及其抗血清。方法:将TB-Chen株轮状病毒NSP3基因插入质粒pETL,构建重组表达质粒pET-NSP3,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白NSP3;用凝胶分离回收的方法纯化该蛋白,免疫豚鼠制备该蛋白的抗血清。结果:构建了重组表达质粒pET-NSP3,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白NSP3,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的28.6%;有效地纯化了目的蛋白并制备了该蛋白的抗血清,Western印迹表明该抗血清能与重组蛋白NSP3发生特异性免疫反应。结论:通过质粒pETL能高效表达轮状病毒NSP3蛋白,该重组蛋白具有较好的免疫反应性,为进一步研究其结构、功能及免疫学性质奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的多克隆抗体。以PCV2毒株(CAU0673)DNA为模板进行PCR,扩增目的片段大小约为702 bp,构建pET30a-PCV2-Cap重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对目的蛋白进行NiNTA树脂亲和层析纯化、复性,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;将纯化后的重组Cap蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,经背部皮下多点注射4次,免疫新西兰大耳白兔,制备成兔抗Cap蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)验证兔抗血清特异性,并用间接ELISA测定抗血清抗体效价。PCR、双酶切和测序鉴定结果表明,重组质粒pET30a-PCV2-Cap构建正确;重组Cap蛋白以包涵体的形式表达,大小约为34 kD,复性后重组Cap蛋白可与PCV2阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体与PCV2重组Cap蛋白和全病毒抗原均可发生反应,ELISA抗体效价 1∶12 800,显著高于商品化疫苗组。     

狐源犬瘟热病毒CDV-FOX-TA株核蛋白基因的原核表达及鉴定

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV) 核衣壳(N)蛋白基因抗原性好的高保守基因片段,将其TA克隆至pMD18-T载体中,再利用酶切、连接的方法将测序正确的N基因目的片段亚克隆到原核表达载体pET24b中6×His Tag编码基因的上游,并将该重组质粒转化大肠杆菌Rosetta 2 (DE3)株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE 分析和Western blot 分析的结果显示,表达产物的分子质量为15 kD,与CDV标准阳性血清呈阳性反应,间接ELISA结果也表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效区分CDV标准阳性与阴性血清,表明大肠杆菌表达的CDV N 蛋白在免疫原性上具有与天然N蛋白同样的特性,可作为检测CDV的间接ELISA包被抗原。     

人免疫缺陷病毒早期蛋白Nef的表达、纯化及免疫原性研究

目的：通过原核细胞表达人免疫缺陷病毒（HIV）Nef抗原,制备特异抗血清,为Nef抗原检测提供技术方法。方法：以HIVBotswana毒株基因组为模板,用PCR法获得Nef蛋白编码基因,将其克隆到pET30a载体中,在大肠杆菌中表达Nef融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清,用真核表达的Nef抗原对其特异性进行分析。结果：构建的Nef融合基因在大肠杆菌中获得表达,相对分子质量约为36x103,免疫BALB／c小鼠获得针对融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1：6400;免疫荧光和Westemblot检测表明,该抗血清能特异地与重组痘苗病毒表达的Nef抗原反应。结论：在大肠杆菌中表达了HIVNef融合蛋白,制备了Nef融合蛋白的高效价小鼠免疫血清,该血清能特异性识别HIVNef抗原,为HlVNef抗原检测提供了技术方法。     

嗜水气单胞菌BYKAH2008AC株外膜蛋白和溶血素双基因的融合表达及免疫原性分析

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的外膜蛋白基因(OmpTS)和溶血素基因(Hly)是其重要的保护性抗原。根据Genbank已发表的两个基因的序列设计引物,扩增其去除信号肽部分的基因片段,再将二者通过柔性片段融合,定向插入到质粒pET32a中构建重组融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得与预期大小108 kD相吻合的融合蛋白条带。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗血清。ELISA和Western Blot检测该抗体效价为1∶4000以上,且该重组蛋白与抗OmpTS兔血清和抗Hly兔血清都呈阳性反应,表明该融合蛋白保留了外膜蛋白和溶血素的免疫原性,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

抗登革病毒2型E蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

为了制备可用于胶体金快速检测试纸条的抗登革病毒2型（DEN2）E蛋白单克隆抗体（mAb）,通过基因克隆获得E基因与质粒pET32a（＋）的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPGT诱导表达重组蛋白。以DEN2重组E蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DEN2E蛋白的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类。结果表明获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞（7C7）,其抗体亚类为IgG1。Western blot显示该株mAb能特异识别重组pET32a-DEN2E蛋白。因此,成功制备出抗DEN2E的1株mAb,为建立快速特异橙测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。     

牛分枝杆菌MPB83基因的原核表达及免疫活性分析

利用PCR技术,以牛型分枝杆菌(M.bovis)Vallee菌株的全基因组DNA为模板,扩增出了一条600bp的MPB83基因片段,将其克隆至pMD18T载体中,经核苷酸序列测定确证后,KpnI/EcoRI双酶切,然后亚克隆到原核表达载体pET30a的相同酶切位点,构建表达质粒pETMPB83,将鉴定的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDSPAGE检测表达情况,重组质粒pETMPB83在30kDa处有一特异表达带,与预计大小相符。经Ni柱纯化后,Westernblot检测纯化蛋白具有免疫活性,用纯化的该蛋白进行动物(兔)接种制备抗血清,用Westernblot和ELISA检测该抗血清的效价和特异性,结果表明特异性较好。     

盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清的制备及鉴定

病程相关蛋白(PRs)在植物抗病抗逆过程中发挥重要作用。盐穗木病程相关蛋白基因HcPR10(GenBank:KF673356)来自盐穗木(Halostachys capsica)在600 mmol·L^-1 NaCl胁迫下的盐抑制差减文库。为探究盐穗木病程相关蛋白HcPR10发挥生物学功能的机制,该研究通过体外表达和纯化HcPR10重组蛋白制备特异性的HcPR10多克隆抗体。并采用双酶切构建原核重组表达载体pET28a-HcPR10,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21诱导表达,通过正交分析优化重组蛋白可溶性诱导表达的条件,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,基于纯化获得的His-HcPR10重组蛋白和转HcPR10拟南芥总蛋白,分别利用ELISA和Western Blotting检测抗血清效价和特异性。结果表明:成功构建重组表达载体pET28a-HcPR10; 正交结果显示诱导温度27 ℃,诱导转速200 r·min^-1,IPTG浓度0.7 mmol·L^-1,诱导时间6 h条件下可诱导表达大量可溶性目的蛋白; ELISA检测抗HcPR10血清效价达1:243 000,Western Blotting印迹结果显示制备的抗血清可以与重组蛋白和转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)中异源表达的HcPR10蛋白特异性结合。该研究获得了效价高、特异性强的盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清,为进一步研究HcPR10的亚细胞定位及生物学功能奠定了基础。     

猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV) NS2-3抗原集中区蛋白,并建立CSFV抗体快速检测方法.本研究以CSFV全长基因组质粒为模板,PCR扩增NS2-3抗原表位集中区,利用扩增片段和克隆载体,构建重组表达质粒,命名为pET32a-NS2-3-1.重组表达质粒转化Rosetta (DE3)细胞,利用IPTG诱导表达, SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定重组表达产物.结果表明,重组质粒pET32a-NS2-3-1在28℃诱导5 h得到高效表达,重组蛋白能够与兔抗CSFV阳性血清发生反应.获得CSFV NS2-3抗原集中区蛋白,并且获得的重组蛋白具有抗原性,能够作为CSFV抗体检测的抗原.     

犬瘟热病毒南京株H蛋白基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以犬瘟热病毒南京株(CDVNJ-15)感染的Vero细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出1.9kb的全长H蛋白基因,双酶切该全长基因,得到1058bp片段,以正确的阅读框架定向克隆于pET-28b(+)中,然后将重组质粒转化宿主菌RosettaTM,在37℃1.0mmol/LIPTG诱导下获得良好表达.经SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白质约38kDa,与预期值一致.免疫转印试验显示,该重组蛋白可被CDVOnderstepoort兔抗血清识别,表明该重组蛋白具备部分抗原性.     

犬瘟热病毒南京株H蛋白基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计一对引物,以犬瘟热病毒南京株(CDVNJ．15)感染的Vero细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出1．9kb的全长H蛋白基因,双酶切该全长基因,得到1058bp片段,以正确的阅读框架定向克隆于pET-28b( )中,然后将重组质粒转化宿主菌RosettaTM,在37℃1．0mmol／LIPTG诱导下获得良好表达。经SDS—PAGE鉴定,表达的融合蛋白质约38kDa,与预期值一致。免疫转印试验显示,该重组蛋白可被CDVOnderstepoort兔抗血清识别,表明该重组蛋白具备部分抗原性。