三株牛源亚洲1型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的亚洲1型口蹄疫病毒(分别命名为F1、F2、F3)为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计1对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的片段,并测定了3个毒株VP1基因的序列.结果表明,3株亚洲1型FMDV毒株VP1基因长度均为633 bp,编码211个氨基酸.3株毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在82.8% ～99.1%之间,推导氨基酸序列同源性在89.1% ～99.1%之间.从系统发生树看,F1株与我国香港2005年牛毒株序列同源性99.5%,属同一遗传谱系,F2株、F3株与2005年引起河北省万全县、北京市延庆县、甘肃静宁县疫情的毒株分属同一个基因群.     

鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用

【目的】研究鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。【方法】设计2对特异性引物,提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,分别RT-PCR扩增得到714bp的DHAV-1VP3和720bp的DHAV-3 VP1基因,并克隆至p MD18-T载体中,然后依次将DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,获得重组表达载体p ET-1VP3-3VP1,进行IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达分析,以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并应用于临床。【结果】经IPTG诱导表达,在大肠杆菌中可稳定、高效地表达DHAV-1VP3-3VP1蛋白。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1∶200,临界值为OD6 50值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与中和试验分别检测DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.7%;初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于DHAV-1和DHAV-3抗体的检测。     

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ扩增我国蓝舌病毒Ｚ１株的ＶＰ７基因,直接将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的重组质粒,用ＤＩＧ标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交,证明插入片段为ＢＴＶ ＶＰ７基因特异性片段。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的９株蓝舌病毒及相关的环状病毒的ＶＰ７基因进行了比     

6株O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来.克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.8%～100%之间.T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86.1%～95.8%之间;发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性.故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDV O型中国拓朴型(Cathaytopotype).     

6株O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来。克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.8%～100%之间。T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86.1%～95.8%之间;发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性。故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDVO型中国拓朴型(Cathaytopotype)。     

蓝狐细小病毒的分离鉴定及其VP1 基因序列分析

从泰安地区送检的疑是细小病毒感染的蓝狐粪便中分离到一株病毒。经理化特性鉴定、血凝谱鉴定、人
工感染蓝狐等鉴定,表明所分离病毒为细小病毒。并且根据GenBank 上发表的犬细小病毒(Canine parvovirus,
CPV)、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)核酸序列,设计扩增VP1 基因的引物,采用PCR 技术扩增所分离
细小病毒的VP1 全基因,将PCR 产物克隆入pMD18 - T 载体,进行测序分析。结果,所分离细小病毒的VP1 基
因全长2 256 bp,编码727 个氨基酸,与CPV 和FPV 参照株的VP1 基因同源性在98. 7% ～ 99. 5% 。VP1 基因的
系统发生分析表明所分离病毒与FPV 的亲源关系最为密切。所分离病毒VP1 蛋白375 位氨基酸残基与CPV 的
VP1 蛋白氨基酸残基一致,但其223 位、236 位、246 位、466 位、707 位、711 位氨基酸残基与FPV VP1 蛋白的
氨基酸残基一致,该病毒VP1 蛋白序列表现出了过渡型序列特征,介于FPV 与CPV 间的过渡类型,这说明所分离病毒为蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BFPV),命名为BFPV - TA,蓝狐可能在CPV 的起源过程起到重要
的作用。     

三株牛源亚洲1型口蹄疫病毒聊基因的克隆与序列分析

以3株国内分离的亚洲1型口蹄疫病毒（分别命名为F1、F2、F3）为研究目标,根据GenBank中注册的FMDV VP1基因的序列设计1对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出含有VP1全基因的片段,并测定了3个毒株VP1基因的序列。结果表明,3株亚洲1型FMDV毒株VP1基因长度均为633bp,编码211个氨基酸。3株毒株彼此之间的核苷酸序列同源性在82．8％～99．1％之间,雅导氨基酸序列同源性在89．1％～99．1％之间。从系统发生树看,F1株与我国香港2005年牛毒株序列同源性99．5％,属同一遗传谱系,F2株、F3株与2005年引起河北省万全县、北京市延庆县、甘肃静宁县疫情的毒株分属同一个基因群。     

2014年安徽省柯萨奇病毒A组16型分离株VP1基因特征研究

研究2014年安徽省手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)患儿中分离的柯萨奇病毒A组16型(Coxsachivirus A 16,CVA16)毒株VP1区基因特征。收集安徽省2014年1月至11月期间413份HFMD患儿咽拭子标本接种敏感细胞分离肠道病毒,用荧光定量RT-PCR鉴定细胞培养物,对CVA16阳性培养物进行毒株VP1区RT-PCR扩增及核苷酸序列测定和基因特征分析,并与国内外参考序列构建基因亲缘性关系树。共分离鉴定出肠道病毒阳性培养物97份,其中CVA16病毒分离株17株,人肠道病毒71型(Human enterovirus 71,HEV71)分离株76株,其它肠道病毒分离株4株,总体病毒分离率为23.49%(97/413)。CVA16基因亲缘性关系分析显示:安徽省2014分离的17株CVA16毒株都属于B1基因型B1b一个分支,它们之间在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分布为分别为95.30%~100%和98.70%~100%,但在B1b分支内形成几个传播链。17株CVA16毒株VP1区核苷酸序列与国内云南、湖南、广东、西藏和江苏地区病毒分离株同源性较高,亲缘性关系近,其中与湖南2013年和广东深圳2014年CVA16病毒分离株同源性最高,为96.40%~99.70%。2014年安徽省分离的CVA16病毒分离株属于B1基因型B1b亚型,为优势流行株;在B1b分支内形成多个小的病毒传播链共同流行。     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒(CPV).提取病毒基因组DNA,并以此DNA为模板,采用人工合成的引物进行PCR 扩增,PCR产物经BamHI、SacI双酶切后,克隆于pUC19质粒的BamHI/Sac I位点.重组质粒pUCVP2经PCR鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明:获得了犬细小病毒内蒙株(CPV-IM)VP2基因的全长克隆, VP2基因全长1755nt,与国外报道的美国1株(CPV-N)、美国2株(CPV-B)和猫全白细胞减少症病毒(FPLV)的核苷酸序列同源性分别为99.32%、98.29%、98.52%,氨基酸序列同源性分别为98.87%、97.09%、97.77%.     

肠道病毒71型SHZH03株VP1基因的进化分析

构建了肠道病毒71型（EV71）中国（深圳）分离株SHZH03全基因组的8个相互重叠的克隆,对其全基因组7406bp的核苷酸进行序列测定,利用DNA—Star软件分析外壳蛋白基因VP1的遗传进化。结果表明,SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的台湾1998年流行株、日本1999年流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000年和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异。以上结果说明我国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于台湾1998年的EV71大规模流行时的毒株。     

北京地区G1—G4型人轮状病毒地方株VP7编码基因的序列分析

本文报告了北京地区流行的４个轮状病毒地方株（Ｇ１－Ｇ４）ＶＰ７编码基因的核苷酸序列。４个地方株的该基因核苷酸全长均为１０６２ｂｐ,读码框架在已往的研究一致。地方株和相同血清型的标准株之间ＶＰ７氨基酸序列具有高度同源性（９２－９４％）,而不同血清型间则是较大（６９－８０％）。不同血清型间氨基酸序列的变异主要存在于高变区内,高变区以外的区域在不同血清型轮状病毒间保守。这一序列分析结果进一步从分子水平分     

柯萨奇B3病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达

本文通过融合柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）ＶＰ１基因与人凝血酶基因,使ＣＶＢ３的ＶＰ１在大肠杆菌中得到稳定的表达,经蛋白扫描仪等测定,表达的融合蛋白占体可溶性蛋白的１１％左右,表牵ＶＰ１产物与抗ＣＶＢ３ＶＰ１单克隆抗体和小鼠抗ＣＶＢ３血清产生较强的免疫反应。与天然的ＣＶＢ３蛋白抗原性相同,应用无关单抗和载体质粒对照均呈现阴性反应,应用表达的ＶＰ１作为抗原,我们对临床部分急性病毒性心肌炎患者血清进行了特     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

北京地区G1-G4型人轮状病毒地方株VP7编码基因的序列分析

本文报告了北京地区流行的４个轮状病毒地方株（Ｇ１－Ｇ４）ＶＰ７编码基因的核苷酸序列。４个地方株的该基因核苷酸全长均为１０６２ｂｐ,读码框架和已往的研究一致。地方株和相同血清型的标准株之间ＶＰ７氨基酸序列具有高度同源性（９２％－９４％）,而不同血清型间则变异较大（６９％－８０％）。不同血清型间氨基酸序列的变异主要存在于高变区内,高变区以外的区域在不同血清型轮状病毒间保守。这一序列分析结果进一步从分子水平分析了地方流行毒株的血清型别,揭示了轮状病毒地方流行毒株和标准株之间ＶＰ７序列的变异情况     

柯萨奇B1病毒VP1基因片段原子力显微镜成像分析

用原子力显微镜(AFM)观察线性DNA并探讨其成像条件。用RT-PCR技术扩增柯萨奇B1病毒VP1基因DNA片段,纯化回收后配制成含和不含1mmol/LMgCl2的水溶液,DNA终浓度为100μg/ml。分别取20μl滴加在新鲜解理的云母片上,吸附1min,用滤纸吸去残液,氮气吹干,在室温下采用MultiModeAFMNanoscopeⅢa的敲击模式成像。同时比较新制备的和多次使用过的探针所获得图像的质量,对两种探针进行扫描电镜观察。电泳证明获得了0.83kb的VP1基因DNA线性片段。Mg2+存在时,DNA在云母片上吸附延展较好,所获图像质量优于无Mg2+时。新制备的探针较多次使用过的探针所获图象分辨率更高。DNA分子的表观宽度为18±2.9nm,高度为0.8±0.2nm。说明AFM能以高分辨率直接观察DNA分子,Mg2+的存在和高质量的探针有助于获得理想的图象。     

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物, 用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D, 用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体, 转化宿主BL21(DE3), 用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳, Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明, VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高, 表达产物的分子量约为48 kD、68 kD, 并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

家蚕传染性软化病病毒（桐乡株）VP1基因片段的克隆及序列分析

以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒（Bombyx mori infectious flacherie virus,BmIFV）BmIFV-CHN001基因组为模板,扩增了编码主要结构蛋白的VP1基因。克隆测序后得到VP1基因片段906 bp。该序列与已发表的日本毒株相比,核苷酸序列的相似性为99.3%,编码氨基酸的相似性为100%,证明该毒株与家蚕传染性软化病病毒日本株的同源性较高。把BmIFV-CHN001的VP1序列与同属的另外6个昆虫小RNA病毒的结构蛋白进行序列比对,构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示这7种病毒具有相近的亲缘关系,而BmIFV-CHN001与蜜蜂囊雏病毒的亲缘关系最近。     

禽脑脊髓炎病毒VP0基因的克隆与序列测定

禽脑脊髓炎（avian encephalomyelitis,AE）又名流行性震颤,是一种主要侵害1月龄内雏鸡的病毒性传染病。该病传染迅速,既可垂直传播又可水平传播,危害极大。世界许多国家和地区均有该病发生和流行的报道。我国学者张泽纪等于1980年首次发现广东有疑似此病,1982年李心平等通过病理学方法确认此病,随后在我国各地均发现该病的发生和流行,给养鸡业造成较大的损失。 　　禽脑脊髓炎病毒（AEV）是一种无囊膜的二十面体对称的病毒粒子,大小为26nm左右。Shafren和Tannock（1991）利用放射性碘标记电泳分析AEV的结构蛋白发现,它主要有3种结构蛋白即VP1、VP2和VP3。Marvil等（1999）测定了AEV疫苗株1?143株的全基因组序列,揭示出AEV结构蛋白有VP1、VP2、VP3和VP4,其中VP2和VP4又合称VP0。我们从河北地区某艾维因肉鸡群自然发病的肉雏鸡脑组织中分离鉴定出一株AE病毒-L2Z株。根据发表的AEV序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,在体外从AEV分离株感染的SPF鸡胚病变组织中扩增出VP0基因,在该片段的5′和3′端均加上KpnI位点,成功地将VP0 cDNA插入到质粒pBssK的KpnI位点之间,获得阳性克隆,并对其进行测序。结果发现,该基因长726bp,编码242个氨基酸,与AEV 1?143株VP0基因的核苷酸与氨基酸之间的同源性分别为95.2%和97.5%,而与小RNA病毒科其它病毒属如人甲肝病毒HAS-15株相应基因核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为50.1%和50.8%,与肠道病毒属的PV-1 Sabin株的同源性分别为20.5%和16.5%,与鼻病毒属的HRV-14株的同源性分别为25.5%和17.8%,与心病毒属的EMCV PV2株的同源性分别为25.9%和19.4%,与口蹄疫病毒属FMDV-C株的同源性分别为26.3%和18.6%,与人类肠道致细胞病变孤儿病毒ECHOV的同源性分别为24.9%和16.1%。在系统发育树上,L2Z株与AEV 1?143株之间的距离最近,其次与甲肝病毒之间距离较近,而与小RNA病毒科其它病毒属之间的距离较远。 　　Marvil等（1999）首先测定出AEV 1143株的全基因序列,发现与甲肝病毒HM-175株之间氨基酸同源性为39%,与该科病毒其它病毒属之间的氨基酸同源性为19%～21%,其中VP0基因与甲肝病毒HM-175株相应基因氨基酸之间同源性达到71.8%,认为AEV与甲肝病毒属之间关系密切。Todd等（1999）对AEV VR株的3′端869bp序列测定表明,它与甲肝病毒相应区域氨基酸之间的同源性为35.7%,均高于与该科病毒其它病毒属相应氨基酸之间的同源性,也认为AEV与甲肝病毒之间最为接近。本试验发现：AEV分离株L2Z株VP0基因与甲肝病毒相应氨基酸之间的同源性为50.8%,而与该科病毒的其它属病毒相应氨基酸之间同源性仅在16.1%～21.9%之间。从系统发育树上也进一步表明,AEV L2Z株与甲肝病毒之间同源性之间距离最短,亲缘关系最近,而与肠道病毒属之间亲缘关系较远。第6次国际病毒学分类报告中将AEV划为小RNA病毒科肠道病毒属,但从我们的实验结果与Marvil等（1999）和Todd等（1999）的报道,从基因水平上证明AEV与甲肝病毒属更接近,而与肠道病毒属亲缘关系较远,因此认为AEV是否归为小RNA病毒科肠道毒属有待进一步确定。 　　本研究成功地进行了AEV分离株VP0基因的克隆与序列测定,为下一步进行AEV基因结构研究打下了基础。