限制性内切酶NotI提纯的新工艺

目前有关限制性内切酶Not I的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化Not Ⅰ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在.为探索限制性内切酶Not Ⅰ提纯的新工艺,从豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidiscaviarum)中克隆出限制性内切酶Not Ⅰ的基因并使之在大肠杆菌中高效表达.首先将由成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)中克隆所得甲基化酶Eag I M(Eag I methylase gene)基因连接到pBR322载体上,转化大肠杆菌ER2566,将豚鼠耳炎诺卡菌中克隆所得的限制性内切酶Not IR(Not I restriction endonuclease gene)基因连接到表达载体pACYC184-PT7上,将此重组质粒转化到上述已转入甲基化重组质粒pBR322-Eag I M的ER2566中,构建成Not I蛋白表达菌ER2566[pBR322-Eag I M,pACYC184-PT7-Not I R].重组工程菌经IPTG诱导可表达限制性内切酶Not Ⅰ,并对诱导条件进行优化使之以可溶形式高效表达.应用(A)KTA purifier 100蛋白纯化系统,对纯化工艺进行创新,通过DEAE Sephrose FF离子交换层析、phenyl HP疏水层析和Superdex 75 10/300GL分子筛层析对蛋白进行提纯.纯化后Not Ⅰ经酶活力及纯度鉴定,其比活力为1.37 × 10(6)U/mg,提纯35倍,得率为17.8%,产量达9.8×10(6)Units /g wet cell,提纯时间缩减为原来的1/10,在产量和效率上较以前报道均有很大提高.该纯化工艺的新方法,为实验室制备及工业化生产Ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴.且该酶的成功获得为后续研究提供了材料,为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考.     

限制性内切酶BamHI、EcoRI、PstI的分离纯化

限制性内切酶是核酸研究工作的重要工具酶,它的纯度直接影响基因分离,基因克隆以及序列分析等实验结果。为了获得品种繁多、纯度达到要求的酶,人们在分离纯化技术上作了不少努力。目前在分离限制性内切酶方法上以     

限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺

目前有关限制性内切酶NotⅠ的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化NotⅠ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在。为探索限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺,从豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidis-caviarum)中克隆出限制性内切酶NotⅠ的基因并使之在大肠杆菌中高效表达。首先将由成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)中克隆所得甲基化酶EagⅠM(EagⅠ methylase gene)基因连接到pBR322载体上,转化大肠杆菌ER2566,将豚鼠耳炎诺卡菌中克隆所得的限制性内切酶NotⅠR(NotⅠrestriction endonuclease gene)基因连接到表达载体pACYC184-PT₇上,将此重组质粒转化到上述已转入甲基化重组质粒pBR322-EagⅠM的ER2566中,构建成NotⅠ蛋白表达菌ER2566 。重组工程菌经IPTG诱导可表达限制性内切酶NotⅠ,并对诱导条件进行优化使之以可溶形式高效表达。应用KTA purifier 100蛋白纯化系统,对纯化工艺进行创新,通过DEAE Sephrose FF离子交换层析、phenyl HP疏水层析和Superdex 75 10/300 GL分子筛层析对蛋白进行提纯。纯化后NotⅠ经酶活力及纯度鉴定,其比活力为1.37×10⁶U/mg,提纯35倍,得率为17.8％,产量达9.8×10⁶ Units /g wet cell,提纯时间缩减为原来的1/10,在产量和效率上较以前报道均有很大提高。该纯化工艺的新方法,为实验室制备及工业化生产Ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。且该酶的成功获得为后续研究提供了材料,为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考。     

BamHI DNA甲基化酶的纯化及对BamHI限制性核酸内切酶限制作用的保护作用

用硫酸铵盐析、磷酸纤维素柱层析和肝素-Sepharose 4B亲和层析从解淀粉芽孢杆菌(Raviflus amyloliquefaciens)纯化了BamHI DNA甲基化酶。并以λDNA为底物,研究了λDNA被BamHIDNA甲基化酶作用后,对BamHI限制性核酸内切酶的切割产生了明显的阻抗作用。     

BamHI DNA甲基化酶的纯化及对BamHI限制性核酸内切酶限制作用的保护作用

用硫酸铵盐析、磷酸纤维素柱层析和肝素-Sepharose 4B亲和层析从解淀粉芽孢杆菌(Rocllus amyloliquefaciens)纯化了BamHl DNA甲基化酶。并以λDNA为底物,研究了λDNA被BamHl DNA甲基化酶作用后,对BamHl限制性核酸内切酶的切割产生了明显的阻抗作用。     

非限制性内切核酸酶Sma的表达纯化工艺及性能研究

目的:大量表达非限制性内切核酸酶Sma并获得高纯度目的蛋白,对其酶活进行鉴定。方法:PCR获得Sma基因片段,构建pET28a-omp A-Sma表达载体,转入E.coli BL21(DE3)中,筛选出不同培养基下,目的蛋白可溶表达量最高的条件。通过渗透休克方法提取目的蛋白,并经离子交换纯化。检测不同的温度条件下Sma的酶活,并与商品化产品进行比较。结果:经PCR和测序证明重组蛋白表达质粒构建正确。可溶蛋白产量为7mg/L,每升培养基获得7 300k U的Sma,纯化后纯度95%,活性达273U/μl(商品化产品为250U/μl)。结论:成功地表达了可溶性非限制性内切核酸酶Sma,纯度高、活性好,各项条件下活性皆不低于商品化产品。     

利用微波-热效应进行限制性内切核酸酶反应的可行性验证

限制性内切酶催化的酶解反应是分子生物学实验中的常用技术.鉴于酶切反应时间长,有人提出采用微波释放的热效应催化限制性内切酶解反应,以期缩短酶解时间.但微波是否能代替传统酶切反应还需验证.本研究设计了一系列的酶切 试验,验证微波酶切是否有效.结果表明：短时间（2 min）微波炉高火处理未导致DNA降解及内切酶失活.对于质粒的单酶切和部分双酶切,短时间（2 min）微波炉处理可替代水浴加热完成酶解反应.对于部分双酶切体系,微波炉处理酶切不完全,不能替代温水浴.使用微波酶解需严格控制时间,切勿时间过长.     

限制性内切酶BglⅠ和BglⅡ的提纯比较

Ⅱ类限制性内切酶BglⅠ和BglⅡ产自圆球芽孢杆菌(Bacillus globigii)。对它们的提纯,已有报道。我们采用只产BglⅠ及同时产BglⅠ及BglⅡ的菌株作为实验材料,比较了磷酸纤维素P11柱和羟基磷灰石柱法及两种     

瓣状内切核酸酶1与肿瘤

瓣状内切核酸酶1(flap endonuclease 1,FEN1)是一种结构特异性核酸酶,由一个核心结构域和一条尾链组成。FEN1在DNA修复过程中冈崎片段成熟时RNA引物的切除,长片段碱基切除修复中瓣状结构的切除等过程中发挥着重要作用。FEN1与不同的蛋白质相互作用,在不同的DNA复制和修复途径中发挥着重要作用。FEN1在肿瘤中有着异常的表达,这表明它可能是一种潜在的肿瘤标记物。     

BamHI DNA甲基化酶的提纯及物理化学性质

 通过硫酸铵盐析,DEAE-纤维素柱层析,磷酸纤维素亲和层析及SephadexG-100凝胶过滤法,从噬淀粉芽孢杆菌HI(Bacillus amyloliguefaciens HI)提纯了DNA甲基化酶。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查,已达电泳均一,比活力提高了326倍。并用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和Sephadex G-100凝胶过滤法测得其天然酶的分子量为273000,又用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测得它的亚基分子量为34500,故该酶有8个分子量相同的亚基。用凝胶电聚焦法测得其pI_(22 c)=9.0。     

限制性内切酶反应缓冲液配制

低盐缓冲液中盐缓冲液高盐缓冲液smal缓冲液 10mM 10mM lmM 10mM 50mM 10mM lmM100mM 50mM 10mM lmM 20mM 10mM 10口IM lmMTris一el(pH7 .5)MgCI:盛TTTr七一el(pH7.5)NaCIMgC】:D口fTNaCITr此一el(pH7.5)MgCI:八TTKCITr认cl(pHS.o)MgCI,奋TT。限制性内切酶反应缓冲液配制 ~~     

几种限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶(简称限制酶)是遗传工程研究不可缺少的工具酶。曾作过一些介绍,新酶不断地扩大,这里仅就Boehringer Mannheim公司商品化生产的几种限制酶列表做一介绍:     

限制性核酸内切酶或特异位点的DNA内切酶

目前对那些在原核生物中看来普遍存在的特异位点核酸内切酶的看法,由于探索重组DNA技术学的工具而受到了严重地歪曲。仅分离到了具有识别3—7个特异碱基范围序列的酶。当然这些内切酶在复合组基因的分析、“逆转遗传学”(“reverse genetics”)的兴起以及在真核中基因表达区的最近突破,特别是在了解肿瘤病毒RNA的作用过程中和免疫球蛋白的表达中基因重排等方面的用途上在过去的五年深为分子和细胞生物学家们体会到了。已发现了在识别顺序中有交错、对称、不对称及简并巨大多样性。同时考虑到特异位点重组和(或)DNA降解方面的遗传学资料,说明我们现在所收集的内切酶只能代表一个程度极其复杂的特异性窄谱。这些酶本身也为生物物理学家们和生物化学家们提供了探索DNA—蛋白质相互作用的微妙问题的丰富材料。     

限制性核酸内切酶或特异位点的DNA内切酶

目前对那些在原核生物中看来普遍存在的特异位点核酸内切酶的看法,由于探索重组DNA技术学的工具而受到了严重地歪曲。仅分离到了具有识别3-7个特异碱基范围序列的酶。当然这些内切酶在复合组基因的分析、“逆转遗传学”(“reverse genetics”)的兴起以及在真核中基因表达区的最近突破,特别是在了解肿瘤病毒RNA的作用过程中和免疫球蛋白的表达中基因重排等方面的用途上在过去的五年深为分子和细胞生物学家们体会到了。已发现了在识别顺序中有交错、对称、不对称及简并巨大多样性。同时考虑到特异位点重组和(或)DNA降解方面的遗传学资料,说明我们现在所收集的内切酶只能代表一个程度极其复杂的特异性窄谱。这些酶本身也为生物物理学家们和生物化学家们提供了探索DNA-蛋白质相互作用的微妙问题的丰富材料。     

限制性内切酶Bam HI的制备

限制性内切酶是DNA体外重组极其重要的工具。Bam HI是使用最多的一种工具酶。它识别碱基的序列为:5′G↓GATTC3′。对质粒_PBR322_PBR317等只有一个酶切位点,同时它恰好切在质粒_PBR322的抗四环素基因上,所以使受体菌失去抗四环素的能力,因此,用这种质粒作DNA体外重组的载体,则便于筛选重组子。目前,Bam HI除广泛用于DNA的体外重组外,还用于DNA的限制性酶切图,DNA     

限制性内切酶MspI的分离纯化

MspI内切酶是Ⅱ型限制内切酶。该酶首先是由R. J. Roberts从Moraxella species中提纯出来的,但有关该酶的纯化方法目前在国内外尚无报道。我们参照Roberts等人提取其它内切酶的方法,经过适当改进,从克隆MspI基因的大肠杆菌中分离、纯化了MspI。     

室温下稳定的限制性内切酶

英国剑桥的Qnadrant分绍了他们的第一批产品,一系列稳定的分子生物学试剂。这些稳定的限制性内切酶不需经冷冻、冷藏或冰冻干燥,在室温下即可保持完全的活性,利于在实验室中贮存。同时解决了酶的运输问题,酶可以无水构型保留全部活性到达使用者的实验室,勿需用冰或干冰进行复杂而昂贵的包装。将限制性内切酶预首分成合适的等分,以缩短准备时间并减少浪费,同时排除了交叉感染的可能性。而且可选择最适的酶活性进行克隆、少量制备和基因组DNA消化。 Quadrant提供的限制性内切酶有2种类型:微离心管和96孔微量培养板。对于高容量基因定位者来说,微量培养板独具优点,提高了生产能力并节省了时间,在两次使用之间能够贮存培养板。单一等分试