γ射线对红细胞嘌呤核苷磷酸化酶的影响 二、酶的某些性质

正常大鼠和小鼠、经700或1000拉德照射的大鼠和小鼠,纯化它们的红细胞嘌岭核苷磷酸化酶,并研究酶的某些性质。主要结果如下: 1.在纯化过程中,从DEAE-纤维素柱梯度洗脱大鼠酶时,收集管中酶活力高峰相当Tris-醋酸盐缓冲液浓度0.107±0.003M,而在同样实验条件下,洗脱小鼠酶时酶活力高峰却相当0.213±0.010M。2.大鼠酶反应的Q_(10)小于小鼠酶,但是其米氏常数高于后者。整体照射可使大鼠酶反应的Q_(10)与米氏常数增加,但对于小鼠酶反应的Q_(10)与米氏常数没有影响。3.对氯汞苯甲酸或二氯化汞可抑制红细胞嘌呤核苷磷酸化酶活力,但辐射对酶活力的抑制曲线无显著影响。4.大鼠酶与小鼠酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳中相对迁移率是不同的,因而它们的电泳图谱也有差异。整体照射对大鼠酶与小鼠酶在电泳中的相对迁移率无显著影响。5.将大鼠酶与小鼠酶的相对迁移率对数与凝胶浓度作图,可得到两条平行的直线。这表明两种酶的分子量相同,而其净电荷却有明显的差异。以上结果说明,大鼠与小鼠的红细胞嘌呤核苷磷酸化酶不是性质相同的酶。电离辐射可使大鼠酶反应的Q_(10)与表观米氏常数增加,而对小鼠酶却无影响。前者反映酶的结构发生了变化,而后者的结构没有改变。     

嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶的融合表达及酶法合成嘌呤核苷类产物

将嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶进行融合,提高生物酶法催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率.设计不同的刚性、柔性连接短肽(Linker),将嘧啶核苷磷酸化酶EcUP与嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP连接融合,考察酶融合蛋白的可溶性表达与活性情况.使用EEEEEEKKK短肽连接的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP可溶性表...     

枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶的纯化及酶学性质研究

目的：对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法：经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果：酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7．5,在30-50℃时热稳定性较好;K^＋对该酶有激活作用,而Na^＋、ca^＋、Mg^＋、Mn^＋等金属离子对该酶有抑制作用;Km值为2．11mmol／L,Vmax值为0．84mmol／（min·L）。结论：分离纯化了枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶,并研究了其酶学性质,为利巴韦林的发酵工艺优化提供了重要的酶学理论基础。     

生长温度对核苷磷酸化酶的影响

通过对不同生长温度下嗜热脂肪芽孢杆菌核苷磷酸化酶活性的测量,初步探讨了高温作为有效诱导手段的可能性     

假交替单胞菌XM2107嘌呤核苷磷酸化酶基因克隆表达、重组蛋白纯化及酶学性质

【目的】嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,EC.2.4.2.1)在酶法合成核苷类药物及中间体中具有广泛应用。本文研究的目标是,获得极地嗜冷菌假交替单胞菌Pseudoa lteromonas sp.XM2107嘌呤核苷磷酸化酶编码基因,并对该酶酶学性质进行研究,以考察该酶在核苷类中间体及药物合成中的潜在应用价值。【方法】利用同源序列PCR技术从Pseudoa lteromonas sp.XM2107基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶基因,测序获得编码序列。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达以及金属螯合层析纯化,对其酶学性质进行初步研究。【结果】经过测序获得了该酶编码基因序列,全长702 bp,共编码233个氨基酸,大小为25 kDa,Genbank登录号为GQ475485。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为50℃,最适酶促反应pH为7.6(25 mmol/L磷酸盐缓冲液),最适酶促反应底物为肌苷(Km值0.389 mmol/L,37℃),且对底物腺苷和鸟苷也有磷酸解活性,在普通温度下具有较高催化活性和较好热稳定性。【结论】来源于Pseudoa lteromonas sp.XM2107的嘌呤核苷磷酸化酶在普通温度条件下具有较高的催化活性及良好热稳定性性质,在核苷类中间体和药物合成中具有较广泛的应用价值。     

relA基因在重组大肠杆菌Bk21合成嘌呤核苷磷酸化酶作用研究

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21中relA基因,获得ArelA突变株。进一步研究表明在LB复合培养中reIA基因对大肠杆菌的生长几乎没有明显影响,但是对其重组蛋白的合成有着较大的影响：降低了25％。结果表明,relA基因在大肠杆菌表达重组蛋白方面有着较重要的作用。     

嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法从产气肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大肠杆菌扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因,然后将扩增的约720bp的基因片段克隆到pET-28b表达载体上,构建重组PNPase的表达载体。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因在三个菌株之间有很高的同源性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带,其分子量约为29.8kDa.该载体的构建为进一步研究核苷及其类似物的生物合成奠定基础。     

relA基因在重组大肠杆菌BL21合成嘌呤核苷磷酸化酶作用研究

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21中relA基因,获得△relA突变株。进一步研究表明在LB复合培养中relA基因对大肠杆菌的生长几乎没有明显影响,但是对其重组蛋白的合成有着较大的影响:降低了25%。结果表明,relA基因在大肠杆菌表达重组蛋白方面有着较重要的作用。     

枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质研究及在利巴韦林酶法合成中的应用

利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶的两种基因deoD和punA,构建工程菌并采用金属螯合层析纯化PNP₇₀₂和PNP₈₁₆,酶学性质研究表明:二者具有一致的最适反应温度(60℃)和最适反应pH值(7~8),PNP₈₁₆磷酸解肌苷的催化效率(k_cat/K_m)比PNP₇₀₂高出11.12倍。底物特异性试验表明:PNP₇₀₂为高分子量的六聚体,而PNP₈₁₆为低分子量的三聚体。分别以纯化酶和工程菌菌体为酶源,以肌苷或鸟苷为核糖基供体,TCA(1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺)为底物,酶法合成核苷类抗病毒药物利巴韦林,PNP₈₁₆和工程菌XL-Blue(pPNP₈₁₆)较PNP₇₀₂和工程菌XL-Blue(pPNP₇₀₂)具有更高的催化速度和底物转化率,表明来源于微生物的低分子量的三聚体PNP在核苷类药物和中间体微生物酶法合成中具有更高的应用价值。     

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Ｇｅｎｂａｎｋ中大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（ＰＮＰ）基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组ＤＮＡ为模板,进行ＰＣＲ扩增,并将扩增产物定向连接到克隆、测序及真核表达载体ＰＣＤＮＡ３中,进行酶切鉴定、测序及序列分析。结果表明ＰＣＲ扩增出７４１ｂｐ大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的ＰＮＰ基因序列且基因插入方向正确,此序列与文献报道的ＰＮＰ基因的同源性为９９．７％。说明克隆的ＰＮＰ基因与文献报道的基本一致,ｐｃＤＮＡ３－ＰＮＰ的构建成功为今后用其进行基因转染来研究ＰＮＰ／Ｍｅｐ－ｄＲ自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。     

大肠埃希菌嘌呤核苷磷酸化酶基因载体的构建及对胰腺癌细胞的作用

目的构建大肠埃希菌（Escherichia coli）嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase,PNP）基因表达载体,研究其生物活性,为肿瘤的基因治疗奠定基础。方法PCR扩增大肠埃希菌K12的PNP基因,T4连接酶将PNP连接人pMSCV逆转录病毒载体,构建重组逆转录病毒载体pMSCV／PNP。pM—SCV／PNP转化感受态大肠埃希菌XLI-Blue,提取pMSCV／PNP,酶切、PCR和测序鉴定。病毒包装细胞293产生重组逆转录病毒pMSCV／PNP,流式细胞仪测病毒滴度。pMSCV／PNP转染胰腺癌细胞BXPC-3,倒置荧光显微镜观察,FACS分离转染阳性细胞（GFP阳性）。RT—PCR检测PNPmRNA在胰腺癌细胞BXPC-3细胞中的表达,MTT法检测PNP基因的生物活性。结果PCR扩增出大肠埃希菌PNP基因（738bp）,酶切和PCR的电泳条带显示pMSCV／PNP,测序结果正常。293包装细胞产生高滴度（3．6×10^7U／m1）重组逆转录病毒pMSCV／PNP。RT—PCR实验结果表明,pMSCV／PNP转染的胰腺癌细胞BXPC-3表达PNPmRNA。前药6-甲基嘌呤-2’-脱氧核苷（MePdR）作用72h浓度达1．00mg／L,BXPC-3／PNP细胞存活率为10．09％,随着MePdR浓度加大,BXPC-3／PNP细胞存活率继续下降直至为0。结论构建了pMSCV／PNP载体,获得了表达大肠埃希菌PNP基因的BXPC-3细胞克隆,PNP／MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞BXPC-3有较强的抑杀作用。     

乙酰短杆菌中核苷磷酸化酶的性质研究

目的：以乙酰短杆菌完整细胞为酶源,研究不同条件下核苷磷酸化酶的性质。方法：将乙酰短杆菌湿茵体置于不同保藏温度及在不同种类缓冲溶液中考察其稳定性;在有或无核保护下核苷磷酸化酶对热的稳定性;并设计核苷的磷酸解反应或合成反应,测定核苷磷酸化酶的活力及酶促反应的袁观米氏常数。结果：乙酰短杆菌中的核苷磷酸化酶经低温保藏可以保持较长时间的稳定性;茵体在60℃处理1小时即失去核苷磷酸化酶的活力,但是添加胸腺嘧啶有明显的保护作用;茵体中核苷磷酸化酶的合成能力明显大于磷酸解能力;对尿苷和5-甲基尿苷的表观米氏常数和最大反应速率分别为16．7、11．4mm01／L,0．0063、0．0041mmol／L．min。结论：含核苷磷酸化酶的乙酰短杆菌完整细胞作为酶源,在低温下可以长时间保藏,反应中的碱基对核苷磷酸化酶的抗热性有益,该菌种可以作为工业上核苷磷酸化酶的来源。     

γ射线辐照嘧啶核苷水溶液的电子自旋共振（ESR）研究

亚硝基特丁烷（ＭＮＲ）为捕集剂,利用自旋捕集技术,对γ射线辐照嘧啶苷水溶液进行了ＥＳＲ研究,确定了胸苷、尿苷和胞苷可产生的自肇捕集自由基的类别,并讨论了自由基形成的机制。     

^60Coγ辐射对亚洲玉米螟体内保护酶活力的影响

作研究了亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guen．)不同虫态(3～4龄幼虫、1～2d龄蛹、当天羽化成虫)体内过氧化物醇(POD)和过氧化氢醇(CAT)活力在不同^60Coγ辐照条件下的变化。结果表明：亚洲玉米螟不同虫杰的POD活力顺序为;雌成虫>1～2d蛹>雄成虫>3～4龄幼虫;CAT活力为：3～4龄幼虫>雄成虫>雌成虫>1～2d龄蛹。辐照处理后,POD活力随辐照剂量的增加而呈上升趋势,三种虫态均以40Krad处理后曲活力最高;CAT的话力变化较大．3～4龄幼虫、1～2d龄蛹和雄威虫都以30Krad处理曲活力最高,雌戚虫以20Krad处理的最高。本试验结果有助于阐明辐射对昆虫生理生化的效应。     

环境参数变化对γ射线诱变微生物的影响

报告了在非自然环境中培养选育青霉菌菌株的一些结论。实验表明随着辐射剂量的增加菌株的致死率也相应增加;当辐照剂量相同时,与自然环境相比其致死率有所提高,且随着非自然环境参数值的增加而增加。当电场强度为３００ｋＶ／ｍ、磁场强度为６００Ｇｓ时,正变率有一极大值。     

酶消化对肿瘤浸润淋巴细胞活力影响的研究

本文系统地研究了酶消化(胶原酶Ⅳ、胶原酶Ⅱ,透明质酸酶和胰蛋白酶)对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)活力、增殖力等影响,并用单个酶消化法与Rosenberg法比较。结果提示:胶原酶Ⅳ或胶原酶Ⅱ消化肿瘤组织块时对TIL细胞活力、增殖力损伤小;透明质酸酶与胰蛋白酶消化对TIL细胞活力,增殖力损伤大。在37℃,1h消化组与4℃,24h消化组对同一来源肿瘤组织酶消化配对比较中,结果提示同一酶4℃,24h消化比37℃1h消化对TIL细胞增殖力损伤小,与Rosenberg方法比较中也发现单一胶原酶消化比三酶联合消化影响小。配对各实验组TIL细胞~3H-TdR掺入率分析中,也反映了类似变化。本文经4℃,24h胶原酶Ⅳ消化后培养的TIL细胞在60天和75天仍对自身靶细胞有杀伤力。     

酶消化对肿瘤浸润淋巴细胞活力影响的研究

本文系统地研究了酶消化（胶原酶Ⅳ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和胰蛋白酶）对肿瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ）活力、增殖力等影响,并用单个酶消化法与Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ法比较。结果提示：胶原酶Ⅳ或胶原酶Ⅱ消化肿瘤组织块时对ＴＩＬ细胞活力、增殖力损伤小;透明质酸与胰蛋白酶消化对ＴＩＬ细胞活力、增殖力损伤大。在３７℃,１ｈ消化组与４℃,２４ｈ消化组对同一来源肿瘤组织酶消化配对比较中,结果提示同一酶４℃,２４ｈ消化比３７