嗜热厌氧乙醇菌JW200转化条件的研究

摘要 嗜热厌氧乙醇菌遗传转化系统的缺少,制约了对该菌理论基础和应用领域的进一步研究。利用聚乙二醇（PEG6000）转化和电转化技术国际首次实现了嗜热厌氧乙醇菌JW200外源基因的导入。PEG转化效率很低,因此选择对电转化条件进行优化,转化效率从4±3.2个转化子/μg质粒DNA提高到50±7.4个转化子/μg质粒DNA。实验表明获得较高的转化效率的必要条件是在细胞密度为OD660 0.2时添加甘氨酸与蔗糖后继续培养2h以及细胞在电击前的收集与洗涤保持低温。本研究为利用基因工程手段改造嗜热厌氧乙醇菌和从分子水平研究胞内乙醇代谢途径奠定了基础。     

红曲菌9903A转化体系影响因素的研究

采用PEG介导的原生质体转化方法,研究了将含有潮霉素抗性基因的质粒pMP-Hygro转入红曲菌9903A的影响因素。实验结果表明,原生质体转化最佳条件为:1.0mol/L的山梨醇为渗透压稳定剂;以含有50mmol/L的Ca2 和最终质量分数为40%的PEG4000为转化介质;最佳原生质体浓度和载体DNA用量分别为1×108个/mL、1μg/100μL原生质体;原生质体再生培养基采用不含无机盐的培养基,再生方式采用原生质体液涂布单层再生培基平板法。得到的平均DNA转化率可达160个/μgDNA。本文所研究的PEG介导的原生质体转化方法可以较好的向红曲菌细胞导入外源DNA,并使外源DNA在红曲菌细胞内大量表达。     

部分酶解酵母高效电击转化研究

以酵母质粒YCp50为外源DNA,电击转化部分酶解酵母宿主菌AB1380,转化效率稳定在10~6转化子/μg质粒DNA左右,比不酶解酵母或酵母原生质球作受体的电击转化效率高一个数量级以上,也比PEG介导的酵母原生质球转化高3～5倍,而且适合于大片段DNA如水稻YAC分子的转化。达最佳转化时的有关技术参数为:新接菌种通气培养至细胞密度1×10~8～1.5×10~8个/ml;转化时细胞密度控制在1×10~9～1.5×10~9个/ml;每毫升酶解缓冲液加15u溶菌酶(lyticase),30℃下处理酵母5min进行部分酶解;电击时,电场设置在6.25kV/cm、电容25μF,电击后直接铺板。     

芽孢杆菌原生质体作为质粒DNA转化的受体

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B3F 7658,短小芽孢杆菌(B. pumilus) AS 1.940,巨大芽孢杆菌(B．Megaterium) AS 1.941,和多粘芽孢杆菌(B. polymyxa) AS 1.878等菌株,既不能作为染色体DNA的转化受体,也不能作为质粒DNA的转化受体。用不同量的溶菌酶处理这些菌株形成原生质体,然后加pUB110质粒DNA,经聚乙二醇6000(PEG)诱导,在含新霉素(400μg／ml)的DM-3再生培养基上恢复细胞壁,培养48小时后,转化子数为1.0 x 103一4.6×105／μg DNA。若同时用PEG和Ca2+ 离子诱导,转化子数可提高2—3倍。质粒pUBll0用EcoRI酶切后,转化子数大大下降(2.0×102转化子／μg DNA)。Eco RI酶切后,用T4连接酶连成环状,转化子数有所增加(1．7×103转化子／μg DNA)。     

PEG介导下香菇的转化

表达载体p301-bG1含有香菇（Lentinus edodes (Berk.)Sing)三磷酸甘油醛脱氢酶启动子驱动下的gus基因和除草剂抗性基因。利用PEG法实现了p301－bG1对香菇原生质体的转化。香菇原生质体与经PEG纯化的质粒DNA混合,用PEG处理后培养于含40ug/mL除草剂的CYM再生平板上,得到了抗除草剂和有GUS活性的转化菌株。虽然这种方法转化效率较低,但不需要昂贵的仪器和限制性内切酶,为蘑菇的分子育种研究提供了一种简便经济的转化方法。     

PEG介导的柱状田头菇遗传转化体系建立

柱状田头菇（茶树菇）Agrocybe aegerita是一种美味的食用菌,具有极高的经济价值。随着其全基因组测序的完成,功能基因组学研究也逐渐展开,其中,高效的遗传转化体系作为技术基础成为研究重点。本研究以柱状田头菇原生质体为受体、潮霉素抗性基因（hph）作为筛选标记,以增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）为报告基因,应用PEG介导法进行柱状田头菇遗传转化体系研究。结果表明,150μg/mL潮霉素可以完全抑制柱状田头菇的生长。30℃下用2%裂解酶液酶解菌丝3h,能够获得最大得率的原生质体。通过PEG介导将构建好的DNA片段转化入柱状田头菇原生质体,通过潮霉素抗性筛选获得转化子,转化得率达到7个/μg DNA。PCR验证和荧光显微镜观察,外源片段成功转入柱状田头菇中并稳定表达。本研究建立的PEG介导转化体系,为柱状田头菇基因功能研究提供了技术基础。     

PEG 介导的苹果腐烂病菌原生质体转化

摘要: 【目的】建立PEG 介导的苹果腐烂病菌原生质体遗传转化体系。【方法】本文利用带有hph 基因的质粒,以苹果腐烂病菌(Valsa mali var.mali) 03-8 为受体菌株,通过PEG 融合法对其原生体进行转化。【结果】于YEPD 内培养48 h 的菌丝,在酶解液浓度为50 mg /mL Driselase + 10 mg /mL Lysing Enzymes 情况下,按10 mL酶液/0. 5 g湿菌体比例,酶解2 h时可以释放出4 × 107 个/mL 原生质体,其转化效率为44 个/μg DNA。对转化子的PCR 检测和Southern 杂交分析表明,hph 基因已经整合进苹果树腐烂病菌的基因组中。转化子在PDA 培养基中继代5 次后,87. 5% 的转化子仍能正常生长,表明外源基因hph 能在苹果树腐烂病菌中稳定遗传。【结论】该转化体系的建立为苹果树腐烂病菌致病相关基因的深入研究奠定了基础。     

杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建

【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。     

Neurospora的一种新的、快速而有效的转化方法

叙述了一种新、快速、有效而可靠的转化Neurospora crassa的方法。本方法用醋酸锂处理萌发的分生孢子,再同DNA保温,然后用聚乙二醇(PEG)处理,然后短时间 热冲击,最后铺选择平板测定。报道了得到高转化率的最适条件。用环状和线状质粒DNA以及基因组DNA都可以得到转化。用相对不纯的DNA制备物如用快速微量制备方法得到的DNA也能进行转化,尽管转化率大大降低。这种转化方法简单而可靠,可大大节省时间和材料。     

影响草地早熟禾（Poa pratensis L.）基因枪转化关键因素研究

将含有DREB1A基因的表达载体,通过基因枪法转化草地早熟禾的胚性愈伤组织,探讨了金粉沉淀剂、金粉直径等因素对转化的影响,同时通过不同浓度潮霉素（Hygromycin,简称Hy）对未转化愈伤组织的筛选,获得最佳筛选浓度。结果表明,适合于草地早熟禾基因枪轰击的条件为：Ca（NO3）2＋PEG4000包被质粒DNA;1μm金粉作为质粒DNA的载体;合适的轰击高度为6cm、轰击次数为1次、无渗透处理。采用Hy作为草地早熟禾转基因植株抗生素筛选标记时,Baron品种愈伤组织继代的临界筛选浓度为100mg/L。     

质粒pXZ101 45DNA转化棒杆菌原生质体的研究

用SDS处理谷氨酸棒杆菌1014(Corynebacterium glutamicum 1014),获得消除质粒的衍生株1014—6。通过质粒pXZl0145(Cmr)转化1014—6菌株的原生质体,研究了转化最适条件。0．6u／ml青霉素处理对数期菌体可明显提高转化效率。转化促进剂PEG以分子量6000,浓度30％为最佳。转化在37℃水浴进行3min效果最好。转化效率最高可达2×104转化子/μg DNA。质粒pXZ10145电已成功地转入钝齿棒杆菌B9(C．Crenatu B9)。并在新 宿主中基本保持稳定。     

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

研究了黑暗链霉菌的基因转移系统,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。多次尝试用质粒pIJ702转化黑暗链霉菌9904原生质体均未成功。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中,表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有oriT的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,获得供体菌ET12567(pUZ8002,pHZ132)。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子进行接合转移,成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌9904菌株的原生质体中,转化率约为103/μg DNA(pHZ132)。     

纤维素酶高产菌株Trichoderma atroviride HP35-3原生质体制备及转化

旨在优化深绿木霉(Trichoderma atroviride)菌株HP35-3原生质体制备和转化条件,便于对该菌株进行遗传操作以提高其纤维素酶产量。分别对制备深绿木霉原生质体的菌龄、酶解时间、酶组分及比例和转化条件进行优化。结果显示,利用3mg/m L蜗牛酶、3 mg/m L溶菌酶和3 mg/m L裂解酶酶组分酶解菌龄10 h的菌丝2 h,获得的原生质浓度达到3.5×107个/m L以上,原生质体再生率为61%。利用原生质体进行PEG介导转化,当原生质体浓度为1×108个/m L、外源DNA为5μg时,转化率达到35个转化子/μg DNA。建立的高效原生质体制备及转化体系可用于深绿木霉的遗传转化及菌株改造。     

水分胁迫引起的两种不同生态型芦苇的DNA损伤与修复

利用DNA解链荧光分析（FADU）法检测两种不同生态型芦苇（Phragmites communis T.)在PEG6000胁迫处理后的DNA损伤。结果表明：无论是20％还是30％PEG6000胁迫处理,耐旱性强的沙丘芦苇的DNA损伤都比耐旱性弱的沼泽芦苇较轻。利用不同浓度的二乙基二硫代谢氨基甲酸钠（DDC）、H2O2、FeSO4以增加芦苇的3种活性氧（O2^-、H2O2、OH）的实验也同样显示出沙丘芦苇抵抗水分胁迫引起的DNA损伤的能力较强。同时,当加入外源活性氧清除剂二甲基亚砜（DMSO）、抗坏血酸（Vc）时,水分胁迫处理的芦苇DNA损伤表现出不同程度的减轻。当PEG胁迫处理的芦苇复水后,DNA损伤随复水时间延长而逐渐减轻,但沙丘芦苇的DNA损伤修复较快而完全。实验初步证明：水分胁迫可引起植物体内DNA损伤且该损伤与活性氧有关,植物的抗旱性与DNA损伤及修复密切相关。     

氩离子注入介导麻黄基因组DNA转化获得产麻黄碱重组酵母菌

通过氩离子(Ar )注入介导蓝麻黄基因组DNA在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化,转化后的酵母菌经BTB指示性辅助筛选、斜面传代、液体培养、铜铬盐定性检识和RP-HPLC定量检测,获得了遗传稳定的以葡萄糖为碳源、NaNO3为氮源生物合成麻黄碱和(或)伪麻黄碱的重组酵母菌3株。液体培养72h,RP-HPLC测试胞外麻黄碱和伪麻黄碱的最高产量分别为11.87mg/L和4.11mg/L;胞内伪麻黄碱最高含量为294.86mg/g干细胞,胞内麻黄碱未检出。分析了Ar 注入介导蓝麻黄基因组DNA在酵母菌中的遗传转化效率,探讨了麻黄基因组DNA大分子的完整性对其在酵母菌中遗传转化的影响。     

染色体DNA转化原生质球构建解烃工程菌

用供体菌C_(20-11)和D_(36-3)染色体DNA转化受体菌T_3原生质球。采用5mg/ml溶菌酶,37℃水浴1小时制备原生质球。原生质球形成率为99％,再生率为72.5％。在30％、PEG6000和0.1MCaC1_2作用下,供体DNA转化受体原生质球。我们用上述条件构建了能够同时降解以下四种碳源:苯甲酸、萘、樟脑、十六烷的工程菌株TCD32-14-1。     

棒状类细菌电击转化中多种条件对转化效率的影响

以质粒PXZl0145电击转化不同棒状类细菌菌株,研究了影响电击转化效率的诸个因素,在含4%甘氨酸的培养基中生长至对数前期的菌体最适用于电击转化,当以同源DNA进行电击转化时,1．μgDNA中转化效率最高可达到8×1O⁶转化子,但用异源DNA时,转化效率要比前者低10²～10³倍。     

糖多孢红霉菌A226 的原生质体转化和染色体同源整合

糖多孢红霉菌的原生质体转化和染色体同源整合,是红霉素生物合成基因改造的重要途径。本研究对糖多孢红霉菌A226原生质体制备和转化条件进行了优化,结果表明以对数生长后期和稳定期菌丝体制备的原生质体转化效率较高;质粒、原生质体和PEG－T缓冲液体积比例为15：40：200（μl)时转化效果较好;比重小原生本的转化效率虽高,但在转化子中有效整合的比例较低;PEG1000和PEG3350对转化效率没有显差异;而Yamamoto转化系统优于Weber转化系统。PCR鉴定、抑菌活性鉴定和质谱分析均表明,转化质粒已整合到染色体红霉素合成基因位点。     

基因枪在水稻遗传转化中的应用及其转化技术的优化

1983年Zambryski等人用根瘤农杆菌介导法进行烟草基因转移,获得了世界上首例转基因植株.随后,应用DNA直接导入技术如电击法(electroporation)和PEG介导法(PEG—mediated)成功地获得了转基因水稻植株.近年来,随着基因枪技术的建立和发展,水稻遗传转化成功的报道逐年增多.目前基因枪技术在植物遗传转化中的应用超过了根瘤农杆菌介导和其它转化方法的应用.这是因为基因枪转化技术不受植物种类的限制,不需要以原生质体作为转化的受体,可以将外源基因直接导入细胞、组织或器官,因而克服了根瘤农杆菌     

利用PEG法建立药用真菌灵芝的转化系统

本文首次建立了一种通过PEG转化缓冲液将外源基因转入灵芝的方法,转化频率约为5~6个/mg(抗性转化子/质粒+107个原生质体)。转化子在不含HmB的培养基上经5代以上的继代培养后仍可以稳定表达HmB抗性。Southernblot检测证明外源基因已经整合到了灵芝的基因组DNA中。本研究为通过基因工程手段定向、快速改良灵芝药用品质以及利用灵芝发酵方法生产一些具有重大经济价值的外源蛋白等应用奠定基础,并且也有助于我们进一步了解灵芝这一大型真菌中的基因的表达调控机制。