氧化铁磁性纳米颗粒介导缺氧诱导因子1α shRNA质粒转染逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐药的实验研究

评价了氧化铁磁性纳米颗粒作为缺氧诱导因子1α shRNA (HIF-1α shRNA) 重组质粒载体进行体内体外转染的可行性及其逆转人肺腺癌耐药细胞株(A549/CDDP)顺铂耐性的效果,并初步探讨相关机制．在成功构建HIF-1α shRNA重组质粒后,分别利用氧化铁磁性纳米颗粒及脂质体介导质粒转染A549/CDDP细胞及其移植瘤裸鼠动物模型,荧光显微镜检测转染效率,RT-PCR及细胞免疫化学检测转染后A549/CDDP 细胞HIF-1α、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance 1,MRP1)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP) mRNA及蛋白质表达,免疫组化检测转染后A549/CDDP移植瘤HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达,MTT法检测转染HIF-1α shRNA前后A549/CDDP细胞对顺铂的耐药性,并检测转染HIF-1α shRNA后A549/CDDP细胞移植瘤的肿瘤生长指数,HE染色检测纳米颗粒转染对裸鼠肝、肾及脑的组织学毒理作用．结果显示,氧化铁磁性纳米颗粒介导转染相对效率高于脂质体介导(P < 0.01),HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞后HIF-1α、MRP1、LRP mRNA及蛋白质表达下降,逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐性82%,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞移植瘤裸鼠动物模型后,移植瘤组织中HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达下降,转染HIF-1α shRNA后抑制移植瘤的生长,且与顺铂有协同效应,纳米颗粒转染后裸鼠肝、肾及脑组织无坏死．这些结果说明,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA的体内体外转染效率高于脂质体,RNA干扰技术封闭HIF-1α基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性及其抑制瘤的生长,其作用可能与HIF-1α shRNA降低HIF-1α、MRP1及LRP表达有关,HIF-1α基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点,磁性纳米颗粒介导HIF-1α shRNA质粒转染具有一定的生物安全性．     

TFPI-2对人肝癌细胞生长增殖、凋亡及AFP合成的影响

目的: 探讨TFPI-2基因对人肝癌细胞Hep3B生长增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表达的影响。 方法: 将重组质粒PCDNA3.1-TFPI-2转染Hep3B细胞并经G418稳定筛选后,RT-PCR和Western blot检测转染前后TFPI-2 mRNA和蛋白表达水平,采用CCK-8法、生长曲线观察TFPI-2对人肝癌细胞Hep3B生长增殖的影响,通过平板克隆形成实验观察单个细胞的增殖能力,RT-PCR检测AFP mRNA的表达,并用电化学发光法测定培养上清液中甲胎蛋白AFP含量,流式细胞仪检测细胞早晚期凋亡情况。 结果: 转染成功的Hep3B细胞检测到TFPI-2 mRNA和蛋白的表达;与转染空载体及未转染的细胞相比,转染TFPI-2的细胞生长增殖能力明显减弱;AFP mRNA表达抑制率为16.51%,AFP蛋白分泌明显低于对照组(P<0.01);流式细胞术检测转染TFPI-2的Hep3B细胞早期凋亡率明显增加(24.03%±7.28% vs 8.77%±3.66%)。 结论: TFPI-2表达可显著抑制肝癌细胞生长和AFP的表达,同时还能诱导细胞早期凋亡。为进一步探讨靶向TFPI-2的肝癌基因治疗提供了实验依据。     

IL27RA对EBV感染的鼻咽癌细胞TRAF1/2表达的调控及其生物学效应

EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染是鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)最主要的危险因素,主要通过肿瘤坏死因子受体相关分子-1/2(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-1/2,TRAF1/2)发挥促癌作用,为探究白介素27受体亚基α(Interleukin 27 receptorα,IL27RA)表达与NPC细胞EBV感染的关系及其生物学效应,本研究采用肿瘤基因组计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库在NPC组织中筛选EBV感染相关信号分子TRAF1/2的潜在相互作用分子,培养携带EBV的NPC细胞株HK-1和C666-1及未携带EBV的NPC细胞株CNE-1及CNE-2,实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)及蛋白质印迹技术(Western Blot)检测IL27RA mRNA及蛋白表达,慢病毒介导细胞转染技术外源性干扰HK-1和C666-1细胞IL27RA的表达,CCK-8检测细胞增殖能力的变化情况,Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化情况。结果显示,NPC组织中存在与TRAF1/2表达均显著正相关的分子IL27RA(相关系数R分别为0.61及0.69,P均小于0.001),同时IL27RA在NPC组织中高表达(P0.001),HK-1和C666-1中IL27RA mRNA及蛋白的表达水平显著高于CNE-1及CNE-2细胞(P0.01),干扰HK-1和C666-1细胞IL27RA表达后,TRAF1及TRAF2 mRNA及蛋白表达显著下调(P0.01),且细胞增殖及转移能力均显著减弱(P0.01)。本研究提示,干扰IL27RA表达可显著抑制携带EBV的NPC细胞TRAF1/2的表达及细胞增殖转移能力,IL27RA有望成为NPC新的分子靶标或标志物。     

叶酸靶向载顺铂羧甲基-β-环糊精纳米复合物的制备及对鼻咽癌的体外抑制效应

为达到鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NeC）的靶向化疗,该研究通过酰胺化反应和配位偶联技术制备叶酸（folicacid,FA）分子靶向载川页铂（cisplatin,CDDP）羧甲基-β-环糊精（carboxymethyl-β-cyclodextrin,CM—β—CD）纳米复合物（FA-CM—β—CD—CDDP）,采用邻苯二胺（o-phenylenediamine,OPDA）比色法检测复合物中CDDP含量,紫外分光光谱检测FA含量,透射电镜观察复合物形态,激光粒度仪测定复合物粒径大小。荧光显微镜观察NPC叶酸受体（folatereceptor,FR）阳性HNE-1细胞及FR阴性CNE-2细胞对偶联FITC的复合物的吞噬及OPDA比色法检测细胞内CDDP的浓度。通过MTT法、集落形成实验和流式细胞术检测复合物对HNE-1细胞增殖能力和凋亡的影响。研究结果显示,复合物中偶联的FA和CDDP浓度分别为340gg／mL和2mg／mL,CDDP包封率达20．00％,复合物粒径均匀且大小为157．8nm。HNE-1细胞内见较多FITC,细胞内CDDP浓度为6．24ng／mL,而CNE-2细胞内FITC较少,细胞内CDDP浓度仅约2．01ng／mL。HNE-1生长抑制率在24h明显高于对照组（CM—β—CD—CDDP）,其IC50（4．80μg／mL）明显低于对照组（6．97μg／mL）,但当所载的CDDP终浓度达到16．00μg／mL时,两组抑制率均达到80％以上;作用48h两组抑制率无明显差异。在24h,当复合物的CDDP终浓度为1．00μg／mL时,HNE—1的集落形成率为33．21％,明显低于对照组（52．27％）。当复合物的CDDP终浓度为0．25μg／mL和1．00μg／mL时,HNE-1的凋亡率分别达12．65％和22．35％,明显高于对照组（6．91％和14.21％）。研究结果表明,成功构建的FA—CM—β—CD．cDDP纳米复合物能够靶向抑制FR阳性的NPC细胞增殖并促进其凋亡。     

RPA1低表达对辐射抵抗人鼻咽癌CNE-2R细胞侵袭迁移及细胞周期的影响*

目的: 探讨复制蛋白A1(RPA1)沉默对人鼻咽癌CNE-2R细胞侵袭、迁移及细胞周期的影响。方法: 采用shRNA技术构建RPA1低表达的CNE-2R细胞模型并通过RT-PCR和Western blot实验验证。选用空白对照组(CNE-2R)、阴性对照组(NC-shRNA)、RPA1低表达组(RPA1-shRNA)3组细胞完成后续实验,通过CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖能力、Transwell实验检测侵袭能力、划痕实验检测迁移能力,流式细胞术检测细胞周期;Western blot实验检测Chk2、p-Chk2、Cdc25c和p-cdc25c蛋白的表达。结果: 与CNE-2R和NC-shRNA组比较,RPA1-shRNA组细胞的RPA1mRNA和蛋白质均显著降低(P＜0.01和＜0.05);RPA1-shRNA组组细胞的增殖、侵袭、迁移能力显著下降(P均＜ 0.05),细胞周期被阻滞在G2/M期(P＜0.01);RPA1-shRNA组细胞Chk2、Cdc25c的表达低于CNE-2R和NC-shRNA组细胞(P＜0.05), 而p-Chk2、p-cdc25c的表达高于其它两组(P ＜0.05)。结论: RPA1低表达抑制辐射抵抗人鼻咽癌CNE-2R细胞的增殖、迁移以及使细胞周期阻滞于G2/M期。     

磁性纳米颗粒作为基因转染载体的研究

通过扫描电子显微镜和Zeta电位仪对磁性纳米颗粒的形貌、粒径、表面电位等进行了表征。利用凝胶电泳阻滞试验分析磁性纳米颗粒与DNA的结合情况,研究磁性纳米颗粒对DNA的保护效果,运用MTT和流式细胞术分析磁性纳米颗粒对细胞的毒性。以绿色荧光蛋白基因为报告基因进行293T细胞的转染,研究磁性纳米颗粒与质粒DNA不同比例条件下对293T细胞的转染效率,并与脂质体(Lipofectamine2000)介导的转染进行比较分析。结果表明,磁性纳米颗粒与DNA可以稳定结合,可以保护DNA免受酶的消化作用,当磁性纳米颗粒与DNA比为1 1时,转染效率最高,优于脂质体(Lipotamine2000)介导的转染,且对细胞的毒害作用小于Lipotamine2000。     

siRNA沉默Survivin基因对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的影响

合成Survivin小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,用于转染人鼻咽癌细胞株CNE2,体外观察Survivin siRNA转染后CNE-2细胞Survivin mRNA、蛋白的表达、细胞增殖和凋亡情况。设计合成3段特异性Survivin siRNA,用siRNA转染鼻咽癌CNE-2细胞株,设置空白对照和阴性对照组,通过Real-time PCR检测CNE-2细胞的Survivin mRNA相对表达量,Western blotting检测Survivin蛋白的表达,流式细胞术及原位细胞凋亡检测转染后细胞凋亡情况。siRNA转染CNE-2细胞后,siRNA 1组和3组mRNA表达抑制率分别为(68.46±7.94)%、(49.44±3.78)%,siRNA 2组结果无显著差异(p0.05)。蛋白相对表达量只有siRNA 1组降低,表达抑制率为(30.61±2.47)%,流式细胞术和原位细胞凋亡检测转染后CNE-2细胞数量明显降低,细胞凋亡比例增高。siRNA干扰沉默Survivin基因能有效抑制CNE-2细胞的增殖和诱导细胞凋亡。本研究为Survivin基因可能作为治疗鼻咽癌的一个靶点,为Survivin基因沉默可能是治疗鼻咽癌高效的途径提供体外实验支持。     

猪肾细胞脂质磁转染系统的构建与表征

磁性纳米基因载体是一种非病毒基因载体,经过功能性基团修饰后能够连接阳离子转染剂构建细胞转染系统。本文将磁转染技术结合常用的脂质体转染,形成了一种新型动物体细胞转染方法,即称脂质磁转染(Liposomal magnetofection,LMF)。这将为体细胞克隆培育转基因动物提供稳定遗传的细胞系。为构建脂质磁性纳米基因载体复合物系统,本研究利用一种磁性纳米基因载体通过分子自组装与脂质阳离子转染剂结合,用于携带外源基因转染动物体细胞。通过原子力显微镜(AFM)观测、ζ电位-粒度等分析表征手段,研究磁性纳米基因载体的形貌、粒径分布、负载及浓缩DNA的方式。结果表明,通过猪肾(PK)细胞的LMF实验,与脂质体(Lipofectamine2000)介导的转染比较,具有较高的转染率,更重要的是克服了脂质体转染瞬时表达的缺陷。MTT细胞毒性试验结果也显示该方法具有较低的细胞毒性。因此LMF是一种切实可行的高效低毒性的细胞转染方法。     

EBV阳性与阴性NPC细胞中AKR1B10的差异表达及生物学意义

研究EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）阳性与阴性鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）细胞中醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)的差异表达及生物学意义。收集NPC组织并检测EBV感染情况及AKR1B10表达水平，比较EBV阳性与阴性NPC组织中AKR1B10表达水平的差异；培养EBV阳性的NPC细胞株HK-1和C666-1、EBV阴性的NPC细胞株CNE-1及CNE-2，检测AKR1B10的表达水平。HK-1和C666-1进行分组，给予10μmol/L、20μmol/L AKR1B10抑制剂处理，20μmol/L AKR1B10抑制剂联合对照溶剂或20μmol/L β-catenin激动剂处理，检测细胞增殖水平、侵袭数目及c-myc、MMP2、MMP9的mRNA表达水平，AKR1B10、总β-连环蛋白（β-catenin）、核β-catenin的蛋白表达水平。结果显示HK-1和C666-1细胞中AKR1B10的蛋白表达水平高于CNE-1及CNE-2;10μmol/L、20μmol/L AKR1B10抑制剂组HK-1和C666-1...     

携带缺氧诱导因子-1α-siRNA的叶酸靶向化的磁性纳米复合物抑制肝癌干细胞增殖的实验研究

目的本研究采用叶酸靶向化的聚乙烯亚胺包被的磁性纳米复合物(Fa-PEISPIO)携带HIF-1α-si RNA真核表达质粒转染CDl33+Hep3B肝癌干细胞,观察其对肝癌干细胞增殖能力的抑制效果并探讨其起效机制。方法采用CD133-PE荧光抗体流式分选Hep3B细胞中的CD133阳性细胞。采用流式细胞术检测分选前后细胞CDl33表达量。将Fa-PEI-SPIO纳米复合物与含HIF-1α小干扰RNA(HIF-1α-si RNA)、阴性对照(NC)-si RNA的真核表达质粒复合,分别形成Fa-PEI-SPIO/HIF-1α-si RNA和Fa-PEI-SPIO/NCsi RNA两种靶向化纳米复合物。分别应用两种纳米复合物转染CDl33~+Hep3B肝癌干细胞,建立Fa-PEI-SPIO/HIF-1α-si RNA(FH)组和Fa-PEI-SPIO/NC-si RNA(FN)组,另设立未转染对照(CT)组。Western-blot法检测各组细胞的HIF-1α和Cyclin D1蛋白表达。平板克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成能力。流式细胞术检测各组细胞的细胞周期。CD133阳性细胞比例、蛋白平均相对表达量、有效克隆形成数量和细胞周期等实验数据以x±s表示,3组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。结果分选前Hep3B肝癌细胞检测CD133阳性率为(2.95±0.04)﹪,分选后CDl33阳性率增加到(92.59±0.05)﹪,差异有统计学意义(t=34.88,P=0.00)。FH组CDl33~+Hep3B肝癌干细胞HIF-1α、cyclin D1蛋白平均相对表达量分别为0.11±0.02、0.38±0.03,CT组分别为0.38±0.07、0.59±0.05,差异具有统计学意义(LSD-t=15.88,23.75;P=0.01,0.00)。FH组和CT组CDl33+Hep3B肝癌干细胞的有效克隆数量为分别为(25.92±5.22)个/孔和(364.00±13.93)个/孔,FH组的有效克隆数量明显低于CT组(LSD-t=-37.67,P=0.00)。与CT组相比,FH组细胞G0/G1期的细胞数量明显增大,出现了明显的G0/G1期阻滞,S期和G2/M期细胞数量明显降低,分裂活跃性较CT组降低。结论纳米复合物Fa-PEI-SPIO可高效负载HIF-1α-si RNA真核表达质粒抑制细胞内HIF-1α表达,进而通过降低cyclin D1表达水平影响细胞周期,并抑制CDI33~+Hep3B人肝癌干细胞的增殖。     

丹参酮ⅡA联合CASC2对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响固有淋巴细胞在脂质代谢中的研究进展

为了研究丹参酮ⅡA联合长链非编码RNA(lnc RNA)癌易感性候选基因2(CASC2)对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响,该研究采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测CASC2在甲状腺癌组织中的表达。将甲状腺癌SW579细胞分为pc DNA3.1组(转染pc DNA3.1质粒), pc DNA3.1-CASC2组(转染pc DNA3.1-CASC2质粒), con组(用与丹参酮ⅡA等量的二甲基亚砜处理),药物-1、2、3、4组(分别用1、2、4、8μg/m L丹参酮ⅡA处理),药物-4+pc DNA3.1组(转染pc DNA3.1质粒且用8μg/m L丹参酮ⅡA处理),药物-4+pc DNA3.1-CASC2组(转染pc DNA3.1-CASC2质粒且用8μg/m L丹参酮ⅡA处理)。分别用细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆检测细胞存活与克隆形成;流式细胞术检测细胞凋亡; Transwell检测细胞迁移、侵袭;蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达。结果显示,与癌旁组织相比,甲状腺癌组织中的CASC2表达量显著降低(P0.05)。过表达CASC2明显降低SW579细胞的存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数和MMP-2蛋白表达量,显著提高细胞凋亡率、P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表达量(P0.05)。丹参酮ⅡA明显降低SW579细胞的存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2蛋白水平,显著提高细胞凋亡率、P21、Caspase-3、E-cadherin蛋白表达水平,且均呈浓度依赖性(P0.05)。丹参酮ⅡA联合CASC2明显降低SW579细胞的存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2蛋白表达量,显著提高细胞凋亡率、P21、Caspase-3和E-cadherin蛋白水平(P0.05)。因此,丹参酮ⅡA联合CASC2可以抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,以及诱导细胞凋亡。     

TRPC3对上皮性卵巢癌细胞株迁移和侵袭的影响

目的:探讨瞬时受体电位通道C3(TRPC3)对人卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法:采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR法分别检测卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2和HEY-T30中TRPC3蛋白和m RNA的表达水平。通过Transwell迁移实验(不含Matrigel胶的Transwell小室)和Transwell侵袭实验分别检测卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2和HEY-T30的迁移、侵袭能力。结果:在SKOV3、ES-2和HEY-T30三种卵巢癌细胞株中,ES-2中TRPC3的蛋白和m RNA表达均显著高于其他两株(P0.05)。Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验显示卵巢癌细胞株ES-2的迁移、侵袭能力均显著高于其他两种细胞株(P0.05)。结论:瞬时受体电位通道C3(TRPC3)在ES-2人卵巢癌细胞中高表达,并可能促进人卵巢癌细胞的迁移、侵袭。     

纳米羟基磷灰石表面修饰及其转染细胞的研究

目的:探讨羟基磷灰石-聚乙烯亚胺(nHA-PEI 10KD)纳米颗粒的癌细胞基因转染效率.方法:通过透射电子显微镜(TEM)观察HA-PEI(10KD)纳米颗粒的形态及粒径,Zeta电位仪测定nHA-PEI和HA在酸、碱、中性环境中的电位,用琼脂糖凝胶电泳检测nHAP-PEI(10KD)与DNA结合的能力,MTT比色法检测nHAP-PEI(10KD)对nepG2细胞的毒性,选用增强型绿色荧光蛋白质粒pEGFP1与nHA-PEI结合后,分别转染真核细胞HepG2、Hela、SW620,计算其转染率.结果:nHA-PEI(10KD)分散程度好,粒径60-80nm,在PH7.2时,Zeta电位42.87mV,能转染实验中的细胞,转然效果最好的是HepG2细胞,其次Hela、SW620,转染率高于PEI(10KD)、nHA,但低于脂质体.结论:通过阳离子PEI修饰HA,可有效将增强型绿色荧光蛋白质粒转入HepG2细胞,HA-PEI(10KD)纳米颗粒复合物有望成为基因传递的有效栽体.     

磁性纳米粒介导沉默PI3Kγ基因调控肿瘤相关巨噬细胞抗小鼠肺癌细胞效应的研究

为了探讨超顺磁性Fe3O4纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)介导的磷脂酰肌醇3激酶γ(phosphatidylinositol 3 kinaseγ,PI3Kγ)抑制表达调控的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)对小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma,LLC)增殖和凋亡的影响,该研究构建了能启动巨噬细胞(macrophage,MФ)特异性表达PI3Kγ催化亚基p100 siRNA的pSilencer-EGFP-SP-p110质粒,通过SPIONs负载成磁性纳米质粒复合物(SPIONs-DNA),在强磁作用下转染MФ,通过普鲁士蓝染色法检测SPIONs-DNA在细胞内的分布,Real-time PCR和Western blot检测细胞PI3Kγp110亚基的表达水平。建立M1、M2型MФ模型,将SPIONs-DNA在强磁作用下转染M2型MФ,通过Real-time PCR和Western blot鉴定细胞表型,明确M2型MФ转化为M1型的强度。采用Transwell系统建立SPIONs-DNA转染的M2型MФ与小鼠LLC细胞的共培养模型,通过锥虫蓝染色法检测LLC细胞的活细胞数并绘制细胞生长曲线,CCK-8法检测LLC细胞增殖情况,硝酸还原酶法检测共培养液上清中NO含量,流式细胞术检测LLC细胞凋亡情况。结果显示,制备的SPIONs-DNA在强磁作用下成功转染MФ并大量分布在细胞胞核周围,SPIONs-DNA转染组细胞PI3Kγp110 mRNA和蛋白表达水平显著低于空白细胞对照组(P<0.05)。建立的M1型MФ高表达iNOS(P<0.001),M2型MФ高表达ARG-1(P<0.001)。M2型MФ转染SPIONs-DNA后细胞iNOS mRNA和蛋白的表达显著增加(P<0.001),ARG-1 mRNA和蛋白的表达显著降低(P<0.01)。在共培养组中,SPIONs-DNA转染的M2型MФ组能大量分泌NO,LLC细胞生长和增殖能力显著降低(P<0.05),凋亡率显著增高(P<0.01)。结果表明,磁性纳米粒负载pSilencer-EGFP-SP-p110重组质粒能够特异性靶向抑制巨噬细胞PI3Kγp110的表达,诱导M2型MФ转化为M1型;其转染的M2型MФ可显著抑制LLC细胞的生长和增值,促进细胞凋亡,这与其大量分泌NO有关。该磁性纳米质粒复合物可诱导TAM发挥抗肿瘤作用,为研究开发有效的抗肺癌基因治疗措施奠定基础。     

SOX7基因启动子甲基化水平对乳腺癌MDA-MB-231细胞株体外迁移和侵袭的影响

目的:探讨乳腺癌MDA-MB-231细胞中,Y性别决定区基因7(SOX7)基因启动子甲基化水平对细胞的体外迁移和侵袭的影响。方法:脂质体转染pcDNA3.0-DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)质粒至MDA-MB-231细胞中,并于24h、48h及72h后,采用蛋白质免疫印迹实验(WB)检测细胞内DNMT3a蛋白表达水平;甲基化特异性定量PCR(Q-MSP)检测DNMT3a处理组、5-aza-C处理组及对照(Control)组MDA-MB-231细胞中的SOX7基因启动子DNA甲基化水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及WB实验检测各组MDA-MB-231细胞中的SOX7 m RNA和蛋白表达水平;细胞划痕实验及细胞侵袭实验检测各组MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力。结果:pcDNA3.0-DNMT3a质粒转染MDA-MB-231细胞24h时,细胞内的DNMT3a蛋白表达水平最高。DNMT3a能够显著提高SOX7基因启动子DNA甲基化水平,而5-aza-C则抑制了SOX7基因启动子DNA甲基化水平(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞中,SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显下降,而5-aza-C处理组SOX7的m RNA及蛋白表达水平均明显增加(P0.05)。与Control组相比,DNMT3a处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力均显著增强(P0.05),而5-aza-C处理组的MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力变化不大(P0.05)。结论:在恶性肿瘤中,SOX7低表达表受其基因启动子高甲基化调节,且乳腺癌MDA-MB-231细胞中低表达的SOX7能够影响细胞的外迁移和侵袭能力。     

利用靶向表皮生长因子受体的磁性纳米载体进行肝癌细胞基因治疗的效果观察

目的本研究采用靶向表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体对磁性纳米基因载体颗粒进行靶向修饰后进行针对肝癌的基因治疗,观察其对肝癌细胞HepG2的基因治疗效果。方法制备靶向EGFR的SPIO磁性纳米基因载体。对肝癌细胞HepG2进行EGFR免疫荧光染色证明其在细胞膜上的表达。以Lipofectamine~(TM) 2000推荐质粒用量的1/20进行分组转染,EGFR-Ab-Poly MAG100基因载体组作为(EP)组;Lipofectamine~(TM) 2000基因载体组作为(LF)组;未转染空白对照细胞作为(NC)组。荧光显微镜观察纳米造影剂的细胞内吞效果。荧光实时定量PCR检测目的基因mRNA表达。western blot法进行蛋白表达鉴定。四甲基偶氮唑盐法检测基因治疗效果。HCCR-2 mRNA、HCCR-2蛋白和Ki67蛋白表达水平数据、A值的比较采用单因素方差分析和t检验。结果免疫荧光法染色观察发现,肝癌HepG2细胞膜高表达EGFR蛋白。磁性纳米基因载体有效链接EGFR抗体。EP组细胞中质粒大量进入HepG2细胞,质粒内吞量大于LF组和NC组。EP组HCCR2 mRNA的相对表达量为(11.25±0.23)%,相对表达量明显低于NC组,差异具有统计学意义(t=23.57,P=0.00)。EP组HCCR2蛋白的相对表达量为(0.13±0.02),明显低于NC组的0.62±0.05,差异具有统计学意义(t=29.31,P=0.00)。EP组Ki67蛋白的相对表达量为(0.22±0.04),明显低于NC组的(0.83±0.07),差异具有统计学意义(t=18.88,P=0.00)。转染24 h、48 h后,EP组的A值明显低于NC组,差异具有统计学意义(t=-22.02,-34.73,P=0.00,0.00)。结论采用EGFR单克隆抗体修饰后的磁性纳米基因载体颗粒,可以实现对肝癌细胞的高效基因治疗,进而实现对肝癌细胞的增殖抑制。     

长链非编码RNA SNHG3对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移与侵袭的影响 *

目的:探讨长链非编码RNA SNHG3对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移与侵袭的影响。方法:构建SNHG3过表达质粒,实验分别设置阴性对照组(pcDNA-3.1+)与SNHG3基因过表达组(pcDNA-3.1+/SNHG3)。将MCF-7细胞转染对照组质粒和SNHG3过表达质粒,采用实时定量PCR 方法检测 SNHG3 mRNA 转录水平,Western blot 检测MMP9及EMT相关蛋白质水平;集落形成实验检测MCF-7细胞增殖能力;划痕愈合实验检测MCF-7细胞横向迁移能力; Transwell 小室实验检测MCF-7细胞纵向迁移能力及侵袭能力。结果:过表达SNHG3后,MCF-7细胞中SNHG3的mRNA水平显著增高(P<0.001);MCF-7细胞的体外增殖能力明显增加(P<0.01),迁移(P<0.01)与侵袭能力(P<0.001)也显著增强,实时定量PCR, Western blot 结果显示SNHG3可激活EMT相关通路。结论:过表达SNHG3可能通过激活EMT通路促进乳腺癌MCF-7细胞的增殖,迁移与侵袭。     

新型阳离子基因传递载体PEI-PBLG的细胞转染研究

对新型阳离子聚合物PEI(10kD)-PBLG进行研究,重点考察其基因转染效率与细胞毒性,探讨其作为基因载体的可能性。通过粒径分析及扫描电镜(SEM)观察PEI(10kD)-PBLG与质粒pEGFP自组装形成的颗粒形态及粒径,预测其进入细胞的可能性。使用MTT比色法分析PEI(10kD)-PBLG、PEI(25kD)-PBLG、PEI(10kD)和PEI(25kD)的细胞毒性差异。选用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP作为报告基因模型,将其与PEI(10kD)-PBLG自组装后,分别转染真核细胞株Hela、COS-7、Vero-E6和ECV304,应用流式细胞术检测细胞转染效率,并比较了血清、缓冲液、细胞谱等多种因素对基因转染效率的影响。PEI(10kD)-PBLG可包裹质粒形成粒径100~120nm的纳米复合物,适合介导质粒进入细胞。该纳米粒复合物对转染缓冲液的敏感度较低,并能够在10%血清存在的条件下,转染全部实验用细胞株,尤其对Hela的转染效率最高,其次是COS-7、Vero-E6和ECV304;其中PEI-PBLG(10kD)/pEGFP复合物转染Hela细胞的比率为45.02%,高于PEI(10kD)/pEGFP的29.16%;PEI(10kD)-PBLG的细胞毒性作用显著低于PEI(25kD)、PEI(10kD)和PEI(25kD)-PBLG。新型阳离子多聚物PEI(10kD)-PBLG在提高PEI介导的基因转染效率的同时降低了其细胞毒性,提高了生物相容性,有望成为基因转移的有效载体。     

EB病毒变异型EBER2对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

EB病毒(EBV)编码小RNA(EBERs,包括EBER1和EBER2)的致癌作用已在多种细胞系中得到证实,我们前期研究发现在EBER2基因发生6处突变的EB-8m变异型可能与鼻咽癌(NPC)的发生相关。本研究探讨变异型EBER2对NPC细胞增殖和凋亡的影响,以进一步明确EBER2基因变异在NPC发生中的作用。分别以B95-8原型和EB-8m变异型EBER2稳定转染EBV阴性NPC细胞系,MTT法和平板克隆检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡。与转染原型EBER2细胞及转染载体的对照细胞比较,转染变异型EBER2细胞的MTT吸光度值和平板克隆形成率增高,细胞凋亡率降低(P均小于0.05),原型和对照之间细胞增殖无差异,但原型的细胞凋亡率亦低于对照(P0.05)。上述结果表明,EB-8m变异型EBER2可通过提高NPC细胞增殖及抗凋亡能力而增强其致癌作用。     

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

本实验主要研究脂质体量、质粒量、细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间、细胞传代次数以及细胞种类对转基因效率的影响。首先研究了脂质体量、质粒量和细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间对小鼠胎儿成纤维细胞(MFFC)的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明,在本实验条件下,用传至3代的MFFC,24孔培养板中每孔接种4-10×10~4个细胞,70%-90%贴满程度,当脂质体(LipofectAMINE)4μg、质粒(pEGFP-N1)0.3μg,复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高, 为30.7%。用此方案比较不同传代次数的MFFC转染效率结果表明,原代细胞的转染效率为10.0%, 3代为28.9%,到15代降到7.2%。说明随着传代次数的增加,转染效率逐渐降低。将MFFC、小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和小鼠颗粒细胞(MGC)分别传至3代,采用上述方案进行转染,转染效率分别是27.8%、13.7%和14.2%。可见不同种类细胞的转染效率不同。细胞周期检测表明,无论是不同代次的细胞还是不同种类的细胞,其转染效率高低与M期所占比例的多少有关。这为如何提高转染效率提供了有利的依据。