冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存及竞争增殖力、化学成分变化

文献报道从冬虫夏草中分离得到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢,本研究检测了蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌及其DNA在冬虫夏草中的共存,同时检测了2个真菌在冬虫夏草成熟过程中的竞争增殖力。应用色谱法和质谱法检测了冬虫夏草及中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱。在冬虫夏草中检测到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢活菌,在虫体和子座中检测到这两个真菌的DNA。从子座露出地表后,冬虫夏草的成熟伴有蛋白质和小分子有机化合物指纹谱的动态变化,中国被毛孢竞争增殖力下降(P<0.001)。中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱均不能与冬虫夏草的成分完全重叠,与中国被毛孢相比,蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与冬虫夏草的指纹谱更相似。结论:中药冬虫夏草的成熟伴有蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌共存于它的虫体和子座,也伴有冬虫夏草化学成分的变化和中国被毛孢竞争增殖力的下降。     

一种冬虫夏草全基因组DNA的提取方法

冬虫夏草是真菌与昆虫形成的复合生物体,本研究建立了一种可同时提取冬虫夏草真菌子座和虫体全部基因组DNA的方法。该方法稳定高效,简便易行,提取纯度高,适用于冬虫夏草多重PCR、Realtime-PCR和DNA指纹图谱等分子水平的研究。     

冬虫夏草不同发育时期蛋白质组iTRAQ质谱分析

本文选定冬虫夏草寄主昆虫幼虫（S1）、僵虫（S2）、子座初期（子座<1cm,S3）、子座早期（1cm<子座<3cm,S4）、成熟冬虫夏草（子座>7cm,S5）、商品冬虫夏草菌核（S6）、商品冬虫夏草子座（S7）及商品冬虫夏草（中期子座≈5cm,S8）8个样品,用定量蛋白质组学方法iTRAQ分析技术对冬虫夏草不同生长发育阶段的差异蛋白质组进行比较。共计获得9 924个不同肽段,鉴定到1 809个蛋白质,其中差异比值1.5倍以上,P<0.05蛋白个数506个,以商品冬虫夏草样本（S8）为参照,比较差异蛋白数量,寄主幼虫（S1）、僵虫（S2）、子座初期（S3）、子座早期（S4）、成熟冬虫夏草（S5）、商品冬虫夏草菌核（S6）及商品冬虫夏草子座（S7）阶段差异蛋白数分别为104、102、34、35、49、46和136个,说明昆虫幼虫、僵虫及子座与商品冬虫夏草样品差异显著。对鉴定蛋白质数据进行了主成分分析（principal component analysis,PCA）,在第三主成分（component 3）上的显著差异,表明成熟冬虫夏草（S5）的蛋白组成不同于商品虫草,说明成熟虫草品质下降。层次聚类（hierarchy clustering）分析结果表明所有样品分为两支,僵虫（S2）和商品冬虫夏草菌核（S6）与寄主幼虫（S1）聚在了一个分支上,而不同发育阶段样品（S3、S4和S5）与商品虫草子座（S7）聚在一个分支上,说明商品冬虫夏草菌核中还残留有寄主昆虫蛋白。冬虫夏草菌核部位的蛋白到子座部位的蛋白呈现由寄主幼虫蛋白向真菌蛋白发育过渡的聚类关系。子集嵌套关系同步子实体生长发育阶段蛋白组成变化随时间的程序性变化的规律。K-均值（K-means）聚类和Gene Ontology（GO）注释分析,提供了冬虫夏草成熟过程中能量代谢通路的变化趋势以及与真菌侵染昆虫和有性生殖相关蛋白质信息。研究结果为理解寄主昆虫对冬虫夏草功能的潜在贡献、子实体形成和发育的分子机制提供借鉴,并为蛋白质组作为冬虫夏草质量标准提供了科学参考。     

至少6个突变基因型冬虫夏草菌在冬虫夏草子座中表达的动态变化

本研究检测了在冬虫夏草成熟过程中突变基因型冬虫夏草菌在子座中表达的动态变化。根据冬虫夏草菌基因内转录间隔区(ITS)序列中大量散在的点突变,设计了8个单核苷酸多态性(SNP)延伸引物,采用SNP质谱基因分型法测定各个SNP位点的单核苷酸延伸反应,观察冬虫夏草子座中转换突变和颠换突变基因型菌在冬虫夏草成熟过程中表达的动态变化。其中5个SNP延伸引物(067721-211,067721-240,067721-477,067721-531和067721-581)位于rDNA ITS1和ITS2段,用于区分GC和AT偏倚基因型,但不区分2个AT偏倚基因型。另外3个延伸引物(067740-324,067740-328和067740-360)位于rDNA 5.8S段,用于区分2个AT基因型。采用PCR+EcoRⅠ限制性酶切法检验2个GC偏倚基因型冬虫夏草菌在冬虫夏草成熟过程中表达的动态变化。结果表明:冬虫夏草子座rDNA ITS1-5.8S-ITS2片段的8个SNP位点的质谱图谱显示冬虫夏草子座中存在至少5个冬虫夏草菌转换突变和颠换突变等位基因。它们的表达在冬虫夏草成熟过程中呈现动态变化。067721-211和067721-477位点的AT偏倚型等位基因的峰高明显高于GC偏倚型;随着冬虫夏草的成熟,这2个位点的AT型等位基因峰高大幅度下降。SNP质谱图不仅显示转换突变的等位基因,颠换突变等位基因也有很高的检出率,它们的峰高在一些位点甚至超过GC和AT基因型等位基因;随着冬虫夏草的成熟,颠换突变等位基因的检出率和峰高趋于下降。在区分2个AT偏倚基因型的研究中,AB067744和AB067740 2个基因型的等位基因同时存在于未成熟冬虫夏草子座中。随着冬虫夏草的成熟,AB067744基因型等位基因的峰高明显降低,而AB067740基因型等位基因的峰高明显升高。PCR产物EcoRⅠ酶切试验发现子座中存在2组GC偏倚型菌,具有完全不同的成熟模式。综上,冬虫夏草子座中存在至少6个突变基因型冬虫夏草菌,其表达随着冬虫夏草的成熟呈现动态变化。这些突变基因型菌表达的动态变化对于冬虫夏草子座的萌发和成熟具有重要菌物学意义。     

分离自冬虫夏草可培养真菌的多样性研究

冬虫夏草是生长于青藏高原的一种名贵中药材。天然冬虫夏草及其微环境中生活着多种真菌。作者使用常规分离培养方法对冬虫夏草的真菌区系进行研究。从天然冬虫夏草的子座、菌核和菌膜3个部位共分离到572个真菌菌株,并根据形态特征将大部分菌株鉴定到37个不同的属。这些菌株经SSCP(single-strand conformation polymorphism)分析后,再根据nrDNAITS序列的相似性(以97%为阈值)共区分出92种不同的分类单元(operational taxonomic unit,OTU)。其中,属于子囊菌的菌株数及OTU数均比接合菌和担子菌多。从菌膜分离的菌株数及OTU数都明显多于子座和菌核。分离自子座的优势真菌是产黄青霉Penicillium chrysogenum,而分离自菌核和菌膜的优势真菌均为玫红假裸囊菌Pseudogymnoascus roseus。尚未最终鉴定的部分真菌可能为新的真菌物种。     

糖类对冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis芽生孢子产量及毒力的影响

冬虫夏草Chinese cordyceps是食药两用的传统名贵资源。其人工培养需要冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis的优质芽生孢子。为获得高产量及高感染力芽生孢子,本研究测定不同糖类培养基对冬虫夏草菌芽生孢子产量及毒力（对小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensis幼虫的存活率、携菌率和僵虫率）的影响。两个冬虫夏草菌株于含6种糖（葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖）的液体培养基中分别培养30、45和60 d,计数芽生孢子产量并将收集的孢子注射感染两个品系的小金蝠蛾6龄幼虫,置于不同温度下观察幼虫的存活率、携菌率及僵虫率。结果显示：不同糖源培养基中芽生孢子的产量差异显著,其中含麦芽糖培养基中芽生孢子产量最高;注射菌株和幼虫品系对被注射幼虫的存活率无显著差异;不同糖源培养基获得的芽生孢子对蝠蛾幼虫的存活率无显著差异,对携菌率和僵虫率产生影响;以含麦芽糖为糖源的培养基、芽生孢子培养时间显著影响被注射幼虫的存活率与僵虫率,其中培养30 d的冬虫夏草菌所注射的幼虫的存活率、僵虫率显著高于60 d的;温度也显著影响被注射幼虫的存活率、僵虫率,10℃的幼虫存活率和僵虫率显著高于14℃、18℃的。研究结果为培养优质冬虫夏草芽生孢子,提高被侵染蝙蝠蛾幼虫僵虫率提供了参考。     

虫草属分子系统学研究现状

近年来的分子系统学研究结果表明 ,麦角菌目 (Clavicipitales)与肉座菌目 (Hypocreales)以及虫草属[Cordyceps(Fr.)Link]与麦角菌科 (Clavicipitaceae)内的有关种属关系密切 ,但虫草属为一多系群 ,其中只有新虫草亚属的种类形成单系群。虫草属种类的进化与寄主有一定的关系 ,有关研究显示它们在亲缘关系相差很大的寄主之间多次转移。多个独立的ITS序列研究表明 ,阔孢虫草 (CordycepscrassisporaM .Zangetal.)、甘肃虫草(CordycepsgansuensisK .Y .Zhangetal.)、多轴虫草 (CordycepsmultiaxialisM .Zang&Kinjo)、尼泊尔虫草 (CordycepsnepalensisM .Zang&Kinjo)与冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.]为同一物种 ;RAPD和ITS序列分析还显示不同地理分布的冬虫夏草存在明显的遗传分化。分子生物学方法在确定有性型与无性型的关系上已经为多种虫草菌提供了有力的证据。本文主要对虫草属分子系统学研究现状进行了综述 ,同时就分子生物学研究中的取样问题、一些分子方法的适用范围以及有性型与无性型的关系等问题进行了讨论。     

冬虫夏草菌侵染及寄生阶段的生长发育研究

冬虫夏草菌侵染进入寄主幼虫血体腔后,断裂形成长梭形的菌体。菌体以顶端出芽的方式增殖,分隔分化,互相质配。质配菌体生长出菌丝充满寄主幼虫血体腔,使幼虫死亡并形成僵虫形的菌核,菌核萌生子座即形成冬虫夏草。     

冬虫夏草成熟过程中冬虫夏草菌及其突变基因型在子座和僵虫体中的差异表达

文献报道了从冬虫夏草(Cs)中同时检出蝙蝠蛾拟青霉(Ph)、中华被毛孢(Hs)和冬虫夏草菌(Os)的多个基因型;Cs的成熟伴有化学成分的改变和僵虫体中Hs竞争性菌落形成能力的下降.同时检验了Cs成熟过程中Os突变基因型生物量的变化.应用Southern杂交检验发现:Cs的成熟伴有Ph和2组Os基因型生物量的显著增加.o...     

冬虫夏草研究的新进展

冬虫夏草是冬虫夏草菌寄生于虫草蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus）幼虫体后发育成的真菌子座和充满菌丝的僵死幼虫的复合体,与人参、鹿茸齐名,为我国三大珍贵滋补防病中药材。冬虫草源流于我国,主产于四川、青海、西藏和甘肃等省,从冬虫夏草的基本概况、生物学特性、理化成分、人工培育现状及其应用前景等进行了综述,以期推动冬虫夏草资源的研究和开发利用进程。     

利用CTAB法和子囊孢子破壁法提取冬虫夏草菌DNA

通过CTAB法从冬虫夏草菌株和天然冬虫夏草不同部位提取DNA,并用PCR扩增进行验证,证明了CTAB法适合从冬虫夏草子座、菌核和冬虫夏草菌培养物中提取DNA。首次报道1种将子囊孢子破壁直接进行PCR扩增的方法,并比较了该方法和CTAB法在提取冬虫夏草DNA方面的差异。2种方法获得的DNA用于PCR扩增均能得到较好的结果。     

冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定

分离工作在四川康定及北京进行。方法是将康定收集的14批新鲜冬虫夏草,经整体灭菌后,分别割取子座、柄和虫体三部,然后将各部再切割成绿豆大小样的接种体,置于含1％胨的PDA上,在20℃温箱中让其生长;也少量地进行了子囊孢子分离,结果获得90％以上是同一种分生孢子阶段真菌的培养物。而且对该培养物的鉴定表明,是被毛孢属(Hirsutella)一新种——中国被毛孢(Hirsutella sinensis sp.nov.)。并根据这些多批次且大数量接种体(1000个以上)、多途径且重复持续分离,连同子囊孢子分离以及1988年康定点上再次分离的相互验证,皆得到同一种真菌——中国被毛孢这一事实,我们初步结论:中国被毛孢是冬虫夏草菌[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]的无性阶段。     

冬虫夏草人工培养研究概述

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是虫草真菌的子座及其寄主蝙蝠蛾(Hepialus armoricanus)幼虫尸体的复合物。本菌属子囊菌纲、麦角科、虫草属,此属的种类很多。据日本学者小林义雄等记载的共有260种,在我国,据梁佩琼等报道,已知的有58种,常见的七种虫草为冬虫夏草、蛹虫草、亚香棒虫草,蛾蛹虫草、大蝉虫草、小蝉虫草、泰山虫草,其     

野生冬虫夏草水提物体外抗HIV-1病毒作用的初步研究

研究分析野生冬虫夏草的水溶浸提物抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的效果及其抗病毒作用的靶点。研究分别选取新鲜虫体、子座、全草、干燥虫体和子座5种不同组分,获得水溶性提取物,采用CCK-8实验检测水提物的细胞毒性;假病毒单周期感染实验评价水提物的体外抗病毒活性;体外检测水提物对逆转录酶活性的影响,应用表面等离子共振(SPR)技术检测水提物与HIV-1Vif蛋白的相互作用。这5种虫草水提物均具有显著的体外抗HIV-1病毒活性,抑制HIV-1逆转录酶的活性,新鲜子座水提物与Vif蛋白有良好的体外结合力。本实验明确了野生冬虫夏草的体外抗病毒活性,其作用机制可能与抑制逆转录酶活性和体外Vif蛋白有关,研究将为抗HIV-1病毒药物的研发提供实验基础。     

基于转录组的冬虫夏草菌微循环产孢研究

为研究冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis）微循环产孢过程中的分子机理,采用高通量测序技术,对微循环产孢前后冬虫夏草菌的转录组进行研究。筛选获得差异表达基因6 902个。Gene Ontology（GO）功能聚类分析表明,差异表达基因主要参与分子功能、胞内运输、核糖核蛋白复合体等生物学通路。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析结果表明,差异表达基因参与了核糖体、嘧啶代谢、蛋白酶体、嘌呤代谢、甘氨酸代谢等过程。Mmc、Mcb、MaH1、MaPP5、MaAGA、Pyk等候选基因不同程度的参与了冬虫夏草菌微循环产孢过程,其中Mcb家族基因可能起到关键作用。通过qRT PCR验证差异表达基因,定量结果与转录组测序结果一致。本研究为进一步揭示冬虫夏草菌微循环产孢分子机制以及关键基因的调控提供了重要信息。     

冬虫夏草的研究简介

冬虫夏草,通称虫草。是我国名贵的真菌药物和高级补品。在我国明代以前,人们已知道应用虫草。从明代中叶开始,就受到东南亚人民的喜爱,在国际市场上享有很高的声誉。冬虫夏草是子囊菌寄生于虫草编幅娥等昆虫体内而形成的。冬天在感染的昆虫内形成菌核,外表仍保持原来虫形,到次年夏季温暖潮湿时适于菌体生长,从虫体头部长出一根棕色有柄的律状子座,长4～11cm,粗约3mm,形似一根野草,为此而得名“冬虫夏草”。由此可见,虫革既不是“冬为虫,夏为草”,也木是“既为虫,又是草”,而是一种虫和菌的结合体。由于冬虫夏草所处的生态环…     

一株产虫草素的冬虫夏草内生真菌 Bionectria ochroleuca OS17

虫草素是一种核苷类似物,具有多种药理作用。利用虫草素产生菌发酵的方式获得虫草素,可能是产生虫草素的一种新方法。为筛选能产虫草素的内生真菌,从中国传统的中药冬虫夏草子实体中共分离得到42株真菌,经PDB液体培养后,采用高效液相色谱（HPLC）鉴定其代谢产物。结果表明：菌株OS17的代谢产物中含有虫草素,且虫草素产量为40.16 mg/L。基于形态学特征和ITS序列分析,菌株OS17被鉴定为淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)。这是首次从冬虫夏草中分离得到能产虫草素的生赤壳属,表明了内生真菌具有产生多种生物活性物质的潜力。     

DNA分子标记技术在真菌系统学研究中的应用及影响

DNA分子标记技术为真菌系统进化研究提供了许多新的方法,真菌分子系统学已成为一门成熟的学科。简述了真菌分子系统学的发展简史和代表性的研究方法以及对真菌系统学的主要贡献,包括将广义的真菌划分为3个类群,粘菌和卵菌不再属于真菌界成员。真菌生命之树项目的研究结果对真菌界高阶分类系统作出重大调整,将先前的4个门(壶菌门、接合菌门、子囊菌门和担子菌门)变为7个门(微孢子虫门、壶菌门、新丽鞭毛菌门、芽枝霉门、球囊菌门、子囊菌门和担子菌门)和4个亚门,并对真菌各类群概念作出修订。此外,DNA分子标记技术对真菌种概念的认识、有性型-无性型关联及分子生态学等研究领域产生了重要影响。     

关于进化真菌学教学内容的讨论

核酸序列的比较研究使进化真菌学的面貌发生了革命性的变化,分子系统发育揭示的关系反映出真菌进化的复杂性和多样性,真菌系统学反映真菌进化关系的自然系统还有很大的距离,有赖于新物种的不断发现和分子系统发育证据的不断丰富。     

中国葡萄座腔菌属分类研究概况

葡萄座腔菌属Botryosphaeria及其无性型包括许多植物病原菌以及有经济价值的类群,是腔子囊菌的重要类群.简要回顾了我国该属真菌的分类研究历史,概述了近年来取得的相关研究进展,提供了中国已知种类检索表,展示建立在分类学基础上的分子系统学研究结果,即葡萄座腔菌属Botryosphaeria是多谱系的类群,可分为多个分支,各分支代表其不同的无性型类群.对开展该类真菌的物种多样性和分子系统学研究进行了展望.