离体培养生产次级代谢产物

根茎共培养生产高水平茛菪胺颠茄（Ａｔｒａｐａｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）和Ｄｕｂｏｉｓｉａｓｐｐ．产生的茛菪烷生物碱阿托品、天仙子胺和茛菪胺具有广谱的药理学效应。全世界茛菪烷销售量估计比阿托品和天仙子胶总和的１０倍还高。在植物中,天仙子胺主要由根产生,然后被转运到植物的气生部分,在那里由６－羟化酶催化转变为茛菪胺。发根土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）－转化的毛根培养物可产生能与完整植株产量相比的天仙子胺,但仅有非常少量的Ａ茛菪胺。在澳大利亚新南威尔士大学和Ｍｏｎａｓｈ大学,Ａ…     

盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H -ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na 区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用.本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H -ATPase B亚基cDNA克隆.测序表明该基因长达1 974 bp,开放阅读框有1 470 bp编码489个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量约为54.29 kD.Northem及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H -ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导,并且在NaCl胁迫下,B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H -ATPase c亚基存在协同作用.盐胁迫下,盐地碱蓬液泡H -ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H -ATPase的数量,从而提高了液泡H -ATPase活性,为碱蓬叶片液泡Na 区域化提供了动力,最终提高了碱蓬植株的耐盐性.     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类,从400mmol/LNaCl处理的盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2)。其中Sscatl(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架。而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段。据编码Sscatl3′端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性则为一个单拷贝基因。Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异;400mmol/LNaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscat1受盐诱导表达,不同盐处理时间下的表达分析也证实。在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达。这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的,生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高。     

翅碱蓬CMO cDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建

从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RTPCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切及克隆测序鉴定.     

用8质粒病毒拯救系统产生H9N2/WSN重组A型流行性感冒病毒

把禽流行性感冒(流感)病毒A／Chicken／Shanghai／F／98(H9N2)的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因cDNA克隆至polⅠ-pol Ⅱ双向转录和表达载体pHW2000,用这两种质粒与8质粒病毒拯救系统中流感病毒A／WSN／33(H1N1)6个内部基因cDNA的质粒组合(6 2重排),共转染COS-1细胞,产生了能在鸡胚中高滴度增殖的H9N2／、WSN重组病毒。用A／WSN／33的8个基因cDNA质粒作对照,也产生了转染子病毒。经过EID50测定和MDCK感染实验,新基因型H9N2／WSN病毒感染鸡胚的能力强(EID50为10^-11／0．2m1),而且对鸡胚的毒力弱,在不加胰酶的情况下不使MDCK细胞产牛病变。经电镜观察,两个转染子病毒的形态与野生型流感病毒相似。反向遗传操作技术的建立,为对禽流感病毒基因功能和疫苗构建等方面的研究提供了新的手段。     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类.从400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬(Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2),其中Sscat1(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架,而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段.据编码Sscat1 3＇端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性为71.9%,在氨基酸水平上的一致性为75%.Southem杂交表明,Sscat1在盐地碱蓬基因组中为多拷贝基因,Sscat2则为一个单拷贝基因.Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异:400 mmol/L NaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2 mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscatl受盐诱导表达.不同盐处理时间下的表达分析也证实,在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达.这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的.生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高.     

几种主要莨菪烷类生物碱在中国茄科植物中的存在

本文报道了莨菪碱,东莨菪碱,山莨菪碱,樟柳碱四种药用莨菪烷类生物碱以及一种和莨菪烷类生物碱可能有生源上联系的红古豆碱在中国茄科植物中的存在情况。结果表明:中国茄科茄族(Solaneae)中的天仙子亚族(Hyoscyaminae),向阳花亚族(Mandragorinae)以及曼陀罗族(Datureae)是此类生物碱最集中的植物群,也是今后寻找此类药物新资源应重点注意的研究对象。通过化学分析,证明矮莨菪(Przewalskia shebbearei)和青海矮莨菪(P.tangutica)的根中含有较高含量的莨菪碱和山莨菪碱,是两种有价值的原料植物。通过对唐古特山莨菪(Scopolia tangutica)的种群中所含上述五种生物碱的观察,发现这些碱在不同植物个体中的存在有变异,而且莨菪碱和山莨菪碱的含量也因产地不同而存在显著的差异。本文的研究结果,不但对进一步利用天然莨菪烷类生物碱的资源具有参考意义,而且对茄科植物的化学分类和系统安排也提供了有价值的资料。     

碱蓬cDNA表达文库的构建

以盐生植物盐地碱蓬（Suaeda salsa)地上部分为材料,提取植物总RNA,纯化出mRNA,合成cDNA第一链,得到双链cDNA后,连接入植物表达载体,构建cDNA表达文库。该文库重组子约10^6。将该文库转化农杆菌GV3101,可直接用以转化拟南芥。     

植物组织中冠瘦碱合成酶活性检测的一种简便有效方法

由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 感染引起的植物冠4瘤(crown gall)细胞除 具激素自养性生长特性外,还具有一类特殊的 基因产物,即冠瘦碱(opines)"'。常见的冠瘦碱 主要有章鱼碱(octopine）和胭脂碱(nopaline) 等。催化章鱼碱合成的酶为章鱼碱合成酶( octopine sy nthase),或叫Lysopine脱氢酶[D- （＋）一lysopine dehydrogenase, 简称LpDH] o 催化胭脂碱合成的酶为胭脂碱合成酶(nopaline sy nthase),或称胭脂碱脱氢酶(nopaline dehydrogenase, 简称NpDH)。即在NADH存在条 件下,LpDH催化丙酮酸与精氨酸的缩合反应, 形成章鱼碱;NpDH催化。一酮戊二酸和精氨酸 的缩合反应,形成胭脂碱。     

兵豆甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆和序列分析及蛋白质二级结构的预测

克隆了云南强抗冷性植物兵豆 (Lensculinaris)GPAT基因的编码区完整的cDNA片段 ,该片段长 1374bp ,编码 4 5 7个氨基酸残基。与豌豆 (Pisumsativum)、蚕豆 (Viciafaba)和长柔毛野豌豆 (Viciavillosa)相比较 (从剪切点起 ) ,氨基酸序列的同源性分别为 96 2 1%、95 6 6 %和 95 6 6 %。应用PSIPREDHFORMAT预测了这 4种植物GPAT酶的二级结构。     

黄芪UGPase cDNA克隆、分析及其在大肠杆菌中的表达

在已报道的UGPase的植物cDNA序列基础上,从膜荚黄芪（Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge)毛状根中分离了此酶的cDNA。此cDNA全长为1831bp,推测编码分子量为51.5kD,等电点为6．01的由471个氨基酸残基组成的多肽。将此cDNA的开放阅读框载入质粒pET28(a)^ 并转入大肠杆菌（Escherichia coli)BL21。SDS－PAGE表明此酶已经在E.coli中获得大量表达,表达量约为总细菌蛋白的40％。酶活分析表明,转化菌中UGPase的活性经非转化菌高0．50－3．27倍,证明此cDNA 可以在原核生物中获得表达。Northern blot表明UGPase在黄芪的根,茎,叶及毛状根中均有表达,在根及毛状根中表达量较高,证明了此酶主要分布于植物贮藏组织的报道。     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)APX 基因的克隆及盐胁迫下的表达

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbateperoxidase ,APX)的全长cDNA(SsAPX) ,基因注册号为AY0 34 893。SsAPX全长 1.1kb ,推导的氨基酸序列长为 2 5 0个氨基酸残基。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的菠菜(Spinaciaoleracea)细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因同源性最高 ,在核苷酸水平上一致性为 87% ,在氨基酸水平上一致性为 89%。Southern杂交表明APX基因在盐地碱蓬基因组中只有 1个拷贝。盐 (NaCl 40 0mmol/L)处理不同时间后的Northern杂交分析表明盐地碱蓬中SsAPX基因在盐胁迫下表达量增加 ,而且在盐胁迫下抗坏血酸过氧化物酶的活性也显著地增加 ,说明该基因受盐诱导。推测抗坏血酸过氧化物酶可能在保护盐地碱蓬免受氧化损伤的过程中起到一定作用     

梭梭CMO基因的克隆与植物表达载体的构建

采用RT-PCR、RACE等方法从超旱生耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中扩增出甜菜碱合成过程中的限速酶胆碱单加氧酶(CMO)编码基因的cDNA序列(命名为HaCMO),其开放阅读框为1 344 bp,推测的氨基酸序列全长为447个氨基酸残基.根据已获得的开放阅读框,构建重组植物表达载体pCAMBIA2300-HaCMO.HaCMO核苷酸序列与藜科几种盐生植物如菠菜(Spinacia oleracea)、山菠菜(Atriplex hortensis)、辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis)、盐角草(Salicornia europaea)和甜菜(Beta vulgaris)等的一致性均在74.5%以上,推导编码蛋白的氨基酸序列一致性均在73.5%以上,表明CMO编码基因在藜科植物中是一种比较保守的基因.研究结果为进一步从分子水平探明梭梭的抗旱、耐盐机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定了基础.     

中国红豆杉紫杉烯合酶cDNA的分离、表达和鉴定

紫杉烯合酶是一种二萜环化酶 ,催化牛儿基牛儿基焦磷酸形成紫杉醇生物合成过程中的中间体紫杉烯。利用PCR扩增同源探针筛选cDNA文库 ,克隆了一个编码中国红豆杉 (Taxuschinensis (Pilg .)Rehd .)紫杉烯合酶 3′端的 2 15 1bp的cDNA片段 ,也通过PCR扩增得到了该基因 5′端的 6 11bp的cDNA片段 ,将这两个cDNA片段拼接在一起 ,得到长 2 712bp的cDNA片段 ,具有一个 2 5 86个碱基的开放阅读框架 (ORF) ,编码包括质体转移肽在内的共 86 2个氨基酸残基 ;该酶与太平洋红豆杉紫杉烯合酶有 97%的同源性 (identity) ,与其他植物萜类环化酶也有较高的同源性。利用融合表达载体pET_32a在大肠杆菌BL2 1trxB中表达 ,所表达的融合蛋白以包含体形式存在。包含体经过变性、复性和再折叠 ,利用His残基亲和凝胶柱层析得到融合的紫杉烯合酶。用毛细管气相色谱 质谱联用对酶促反应产物进行分析 ,结果表明 ,融合的紫杉烯合酶能催化产生 4(5 ) ,11(12 )_紫杉烯     

植物维生素C过氧化物酶研究进展

维生素C过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是植物体内的重要酶系,是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分,是清除H2O2(特别是叶绿体中的H2O2)的关键酶.本文综述了维生素C过氧化物酶表达调控方面的研究进展,包括逆境(干旱胁迫、空气污染、微量元素缺乏、离子胁迫、过度光强、照射以及盐胁迫等)与APX的表达调控、植物细胞程序性死亡(PCD)与APX的表达调控、植物生长发育与APX的表达调控、植物进化与APX表达调控等.植物体内的APX基因包括基质和类囊体两类,不同的APX基因序列存在一定差异,本文还综述了这两类APX基因在植物方面的分离和克隆进展情况,同时对APX基因的遗传转化进行了简要回顾,最后指出了APX今后的研究方向.     

紫草乌中生物碱成分及其对H9c2细胞毒性研究

为了解我国特有药用乌头种紫草乌(Aconitum episcopale)的生物碱类化学成分及其对大鼠心脏细胞H9c2的细胞毒性,从紫草乌中分离出10个C19-二萜生物碱,根据理化性质和波谱数据,其结构分别鉴定为滇乌碱(1)、粗茎乌头碱甲(2)、黄草乌碱丙(3)、黄草乌碱甲(4)、丽乌亭(5)、猎鹰乌头碱(6)、14-O-乙酰萨卡可尼亭(7)、萨卡可尼亭(8)、查斯曼宁(9)和展毛黄草乌碱A (10)。化合物5、6和10为首次从该植物中分离得到。化合物1～4、6～7和9～10对大鼠心脏细胞H9c2增殖的半数抑制浓度为163.8～341.6μg/m L,表明紫草乌中的生物碱对H9c2细胞具有毒性作用。     

黄花棘豆生物碱成分研究

采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20和半制备HPLC等色谱手段对草原毒草黄花棘豆(Oxytropis ochrocephala Bunge)生物碱成分进行分离纯化,从全草提取物中分离得到8个生物碱成分。利用MS、1H NMR和13C NMR波谱技术鉴定化合物结构为槐定碱(1)、槐胺(2)、异槐定碱(3)、苦参碱(4)、7,11-去氢苦参碱(5)、槐果碱(6)、羽扇豆碱(7)和苦马豆素(8)。化合物1~6为首次从棘豆属植物中分离得到。     

三角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶基因的克隆与序列分析

多不饱和脂肪酸具有重要的生理和保健功能.利用基因工程手段在植物和微生物中生产多不饱和脂肪酸是研究的热点.Δ6脂肪酸延长酶是多不饱和脂肪酸合成中的关键酶,克隆了三角褐指藻的Δ6脂肪酸延长酶基因的cDNA和DNA序列,并对该基因的基因结构、翻译后修饰及起源进化进行了分析.结果显示,三角褐指藻的Δ6脂肪酸延长酶基因有两个内含子,该酶属于ELO系列延长酶,具有磷酸化及N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰等翻译后修饰.BLAST结果表明,在三角褐指藻中很有可能存在两个Δ6脂肪酸延长酶基因.     

藏药熏倒牛化学成分研究

利用色谱对藏药熏倒牛进行化学成分研究.从藏药熏倒牛(Biebersteinia heterostemon Maxim.)中分离鉴定了6个化合物,采用波谱技术分别鉴定为hypolaetin 7-O-β-xylopyranoside (1)、山羊豆碱 (2)、反式-4-羟基山羊豆碱 (3)、甘露糖醇 (4)、伞形花内脂 (5)、槲皮素 (6).对化合物1的1H、13C NMR信号进行了准确归属,化合物1～4均为首次从该植物中分离得到.     

忽地笑中石蒜碱酶法提取及分离工艺研究

对复合酶法提取忽地笑石蒜碱的工艺进行优化,并用阳离子交换树脂分离石蒜碱。以纤维素酶与果胶酶的水溶液为提取溶剂,采用L9(34)正交试验考察了酶解p H、酶加入量、酶解时间和酶解温度等影响因素,以石蒜碱得率为指标,得最优提取工艺为:料液比1∶10,p H 4.5,酶添加量4%,酶解温度50℃,提取时间2.0 h,石蒜碱得率为0.1750%。D-001树脂纯化条件为:上样液p H为2,以3 BV/h流速上样,以含1.5 mol/L氨水的70%乙醇洗脱,流速为3 BV/h,初步分离后石蒜碱含量为15.28%。研究结果可为石蒜碱工业化生产提供参考。