阿司匹林可抑制吗啡引起的HT22 细胞Wnt通路的激活

目的:研究阿司匹林对吗啡引起的Wnt通路的上调的影响。方法:在大鼠海马神经元元细胞系HT22细胞上建立了慢性吗啡成瘾模型,然后运用免疫荧光技术和Western blot技术检测wnt通路中β-catenin蛋白的表达变化变化,同时应用报告基因技术检测Wnt通路下游转录因子的活性。结果:在慢性吗啡成瘾模型组,β-catenin蛋白的表达显著增加,而在接受了6 h的阿司匹林预处理的慢性吗啡成瘾模型组,β-catenin蛋白的表达受到了显著的抑制。结论:阿司匹林可抑制吗啡引起的Wnt/β-catenin通路水平的过表达。     

RNA干扰c-maf基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨RNA干扰c-maf基因表达对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及机制。方法:将人骨髓瘤细胞株NCI-H929分为正常对照组、转染si RNA Control的阴性对照组和转染si RNA c-maf基因的沉默组,转染48 h后,提取细胞中的蛋白,Western blot检测各组细胞中c-maf的蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved caspase3及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin和Cyclin D1蛋白表达。结果:阴性对照组c-maf的蛋白表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05),沉默组c-maf的蛋白表达显著低于正常对照组(P0.01),而阴性对照组c-maf的蛋白表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。与阴性对照组比较,沉默组的细胞凋亡率显著升高,Cleaved caspase3蛋白显著上调表达,β-catenin和Cyclin D1蛋白显著下调表达(P0.01)。结论:RNA干扰c-maf基因表达可诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

棉铃虫Wnt-1基因克隆、多克隆抗体制备及在滞育和非滞育蛹脑中的表达检测

【目的】Wnt1蛋白是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究旨在克隆棉铃虫Helicoverpa armigera Wnt1基因,制备多克隆抗体,进而从蛋白水平初步研究该蛋白在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况。【方法】通过RACE的方法克隆棉铃虫Wnt1基因。根据获取的序列构建Wnt1的真核表达载体并调查其亚细胞定位,同时构建原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达、纯化后免疫兔子,制备多克隆抗体。最后用Western blot的方法检测Wnt1蛋白在两种发育状态蛹脑中的表达情况。【结果】成功克隆了棉铃虫Wnt1基因(Gen Bank登录号为KJ206240)。Wnt1定位在细胞质,通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的Wnt1抗体效价高达1∶625 000。Western blot结果表明滞育蛹脑中Wnt1蛋白水平明显低于非滞育蛹脑。【结论】获得了高效价的棉铃虫Wnt1多克隆抗体。我们的结果表明滞育蛹脑中Wnt/β-catenin通路很有可能受到抑制。本研究结果为进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

飞燕草素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌的机制研究

为研究飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。免疫组化检测裸鼠乳腺肿瘤组织和肺组织转移瘤Ki-67及乳腺肿瘤组织蛋白水解酶超家族基质金属蛋白酶-7(matrix metallopeptidase 7,MMP-7)的表达水平;Western blot检测移植瘤Wnt/β-catenin通路β-联蛋白(β-catenin)、磷酸糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)及通路下游细胞周期相关蛋白cyclinD1、原癌基因c-myc和MMP-7的蛋白水平表达,体内外实验发现飞燕草素不仅能抑制裸鼠异种移植瘤生长及乳腺癌肿瘤组织和肺组织转移瘤Ki-67表达还可以明显降低乳腺癌MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin和p-GSK-3β下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白的表达。本研究证实飞燕草素能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,发挥抑制乳腺癌的作用。     

OPN对卵巢癌Hey细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)对卵巢癌Hey细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其可能涉及的分子机制。方法:选择卵巢癌细胞株Hey、HO8910、A2780和正常卵巢上皮细胞IOSE80,采用Western blot检测OPN蛋白的表达情况。对OPN表达量相对较高的Hey细胞株的OPN基因敲减或过表达,运用CCK-8、平板克隆实验、细胞划痕、Transwell侵袭实验等方法研究OPN对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,采用Western blot检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc的表达情况。结果:OPN在卵巢癌细胞株Hey、HO8910、A2780内均有表达,且表达量均高于正常卵巢上皮细胞IOSE80。si RNA-OPN转染卵巢癌Hey细胞沉默OPN表达,CCK-8和平板克隆实验显示沉默OPN能够降低Hey细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell侵袭实验显示下调OPN可降低Hey细胞的迁移和侵袭能力,Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc表达下降。ex-OPN转染Hey细胞使OPN表达升高,与对照组相比,OPN过表达能够增强Hey细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc表达升高。结论:OPN能够促进卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,该作用可能通过促进Wnt/β-catenin信号通路实现。     

Wnt/β-catenin信号途径在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的探讨Wnt/β-catenin信号途径在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞（HKC）,分为正常糖组、甘露醇对照组及高糖组。采用免疫细胞化学观察β-连环蛋白（β-catenin）表达情况;Westernblot检测Wnt4、β-catenin、E-钙粘蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平;逆转录-聚合酶链反应检测Wnt4和β-cateninmRNA表达水平。结果高糖组较正常糖及渗透浓度对照组Wnt4蛋白及mRNA、α-SMA蛋白表达增高,E-cadherin表达降低,β-catenin总蛋白及mRNA水平无明显变化,细胞浆及核内蛋白表达增强。高糖刺激肾小管上皮细胞Wnt4及核β-catenin蛋白表达呈时间依赖性,于高糖刺激后12h增强,24h达到高峰。结论Wnt/β-catenin信号通路可能参与了高糖介导的肾小管上皮细胞转分化过程。     

红景天苷通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化

目的:以小鼠骨髓间充质干细胞系D1细胞为研究对象,探讨Wnt/β-catenin信号通路介导的红景天苷诱导D1细胞向神经细胞的定向分化。方法:实验分为对照组(D/F12完全培养基)和红景天苷诱导组(100μg/mL+D/F12完全培养基).将细胞分别诱导12、24、48和72 h后,采用细胞免疫荧光化学染色方法检测β-catenin和Gsk-3β的阳性细胞率。利用红景天苷分别诱导MSCs 1,2,8,12,24,48和72 h后,利用实时PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达;采用Westernblot方法分析D1细胞诱导12、24、48和72 h后,β-catenin和Gsk-3β蛋白的表达;运用Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂DKK1阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot方法分析红景天苷对β-catenin和NSE蛋白表达的影响。结果:红景天苷诱导24 h时β-catenin的阳性率可达55.76%,与其他组和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),诱导24 h后Gsk-3β的阳性率与其他时间和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。实时PCR检测结果显示,红景天苷诱导MSCs不同时间能促进Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子Wnt3a、Ax-in2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达,诱导不同时间Wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达不尽相同。Westernblot结果表明,红景天苷诱导D1细胞12 h和24 h时β-catenin蛋白的表达明显上调,且与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.05);随着作用时间的延长,Gsk-3β蛋白的表达增加且差异具有统计学意义(P<0.05),阻断Wnt/β-catenin信号通路后,β-catenin和NSE蛋白的表达水平明显下调。结论:红景天苷能诱导D1细胞定向分化为神经元样细胞,红景天苷通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现其诱导MSCs向神经细胞定向分化。     

参麦注射液对内毒素诱导心肌细胞凋亡的抑制作用及细胞Wnt2/β-catenin表达的影响

为探讨参麦注射液诱导心肌细胞凋亡的作用机理,本研究分别选取对照组、内毒素(LPS)处理组、参麦注射液(SMI)+内毒素(LPS)处理组,共3组小鼠心肌细胞进行试验。通过MTT检测了各实验组的心肌细胞存活率,利用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡数量,最后利用RT-PCR和Western blotting分别检测心肌细胞Wnt2/β-catenin m RNA的表达和细胞内Wnt2/β-catenin蛋白的表达。结果显示SMI进行剂量干预后,内毒素诱导心肌细胞存活率显著升高(p0.05)。当SMI的干预量为0.8 g/L时,细胞存活率高于LPS组(p0.05);SMI以1 g/L剂量进行干预时,细胞存活率显著高于LPS组(p0.01)。同时,SMI干预的心肌细胞中,UR、LR区的细胞比例较LPS组有显著下降(p0.05)。SMI干预内毒素诱导心肌细胞后,显著逆转内毒素诱导心肌细胞内Wnt2/β-catenin m RNA的表达(p0.05),并且Wnt2/β-catenin蛋白的表达也得到显著性逆转(p0.05)。该结果表明参麦注射液主要是通过影响心肌细胞Wnt2/β-catenin信号通路,从而抑制内毒素诱导的心肌细胞的凋亡。     

光遗传技术通过Wnt/β-Catenin通路对新生神经元的影响*

目的:探讨Wnt/β-catenin信号通路光遗传技术在促进新生神经元成熟中的作用。方法:从胎鼠大脑皮层中提取神经干细胞,用携带DCX-ChR2-EGFP基因的慢病毒感染神经干细胞,观察神经干细胞分化为新生神经元后DCX的表达。实验细胞分为3组(n=9):对照组、NSCs+EGFP和NSCs+ChR2组。其中对照组为正常培养的NSCs(NSCs组);NSCs+EGFP组为携带DCX-EGFP基因慢病毒感染神经干细胞组;NSCs+ChR2组为携带DCX-ChR2-EGFP基因慢病毒感染神经干细胞组。病毒感染后48 h后连续3 d行470 nm蓝激光照射,然后检测各组NeuN⁺阳性细胞(成熟神经元标志物)的密度和NeuN⁺/Hoechst比值情况;Western blot检测各组成熟神经元相关蛋白MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平和Wnt/β-catenin通道相关蛋白TCF4和β-catenin蛋白的表达水平。用L-型钙通道阻断剂100 μmol/L维拉帕米或50 μg/ml的β-catenin抑制剂Dkk1处理NSCs+ChR2组细胞,然后行Western blot检测各组MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平。结果:连续3 d 470 nm蓝激光照射后,NSCs+ChR2组中NeuN⁺阳性细胞密度(成熟细胞)和NeuN⁺/Hoechst明显高于NSCs组和NSCs+EGFP组(P均＜0.05);Western blot检测的MAP2、NeuN、Neurog2、NeuroD1、GluR2蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、TCF4表达水平均明显高于NSCs组和NSCs+EGFP组(P均＜0.01);L-型钙通道阻断剂维拉帕米或β-catenin抑制剂Dkk1处理NSCs+ChR2组细胞后MAP2、Neurog2、NeuroD1和GluR2蛋白表达水平明显下降(P均＜ 0.01),NeuN表达水平也下降(P＜0.05)。证明ChR2通道蛋白开放产生阳离子内流促进新生神经元成熟,是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。结论:光遗传学方法通过Wnt/β-catenin信号通路促进新生神经元成熟。     

人乳头瘤病毒16 E6蛋白通过Wnt/β-catenin通路促进食管癌Eca109细胞增殖、迁移的实验研究

人乳头瘤病毒16(Human papillomavirus 16,HPV16)感染与食管癌的发生密切相关,HPV16编码的HPV16E6蛋白是主要的致癌蛋白,已经在宫颈癌细胞中被证实能够促进癌细胞的增殖、迁移,同时也可激活Wnt/β-catenin通路。但HPV16 E6蛋白对食管癌细胞增殖、迁移的调控作用及机制尚未阐明。为研究HPV16 E6蛋白对食管癌Eca109细胞增殖、迁移及细胞中Wnt/β-catenin通路的调节作用,本研究培养食管癌Eca109细胞并分组,空白对照组用不含药物及质粒的DMEM处理,空白pcDNA3.1组转染空白的pcDNA3.1质粒,HPV16 E6组转染HPV16 E6基因的pcDNA3.1质粒,HPV16 E6+XAV组转染HPV16 E6基因的pcDNA3.1质粒、同时加入β-catenin抑制剂XAV939;并检测细胞的增殖、迁移活力及细胞中增殖基因、迁移基因、Wnt/β-catenin通路基因的表达。结果显示,转染24h后,HPV16 E6组细胞的增殖活力、迁移活力以及细胞中c-myc、cyclinD1、bcl-2、HMGA-2、N-cadherin、Wnt2、β-catenin的蛋白表达量均明显高于空白对照组、空白pcDNA3.1组;HPV16 E6+XAV组细胞的增殖活力、迁移活力以及细胞中c-myc、cyclinD1、bcl-2、HMGA-2、N-cadherin、β-catenin的蛋白表达量均明显低于HPV16 E6组,Wnt2的蛋白表达量与HPV16 E6组比较无明显差异。本研究揭示,HPV16 E6蛋白能够促进食管癌Eca109细胞的增殖、迁移且该作用与激活Wnt/β-catenin通路有关。     

BMSC共培养对人瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的影响

该实验探究人骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC)能否通过旁分泌作用影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast, KF)中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)的表达,从而影响TGF-β/Smad信号通路。培养BMSC、KF及正常人皮肤成纤维细胞(normal human skin fibroblast, NHDF),使用0.4μm微孔孔径的悬挂式细胞培养皿构建BMSC与成纤维细胞之间非接触的细胞间接共培养模型。通过免疫荧光、激光共聚焦技术、Western blot和qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况。Western blot和qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子TGF-β1、Smad7的表达。在成功构建共培养模型后,利用细胞免疫荧光和激光共聚焦技术, Western blot及qPCR检测各组细胞内DNMT1的表达情况,结果显示, DNMT1在KF中高表达而在NHDF中呈低表达,共培养组KF较非共培养组DNMT1的蛋白和m RNA水平表达明显降低(P0.01)。利用Western blot, qPCR检测TGF-β/Smad信号通路相关分子的表达,结果显示较非共培养组,共培养组KF中TGF-β1在蛋白水平表达显著降低(P0.01),抑制性蛋白Smad7在m RNA水平表达增高(P0.05)。研究证实,人BMSC可能通过旁分泌作用抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞中DNMT1的表达,从而抑制TGF-β/Smad信号通路,使瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖趋于正常。     

HepaCAM通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞T24的增殖

该研究探讨了肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,Hepa CAM)对膀胱癌细胞T24增殖的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。T24细胞做空白处理、空载腺病毒(Ad-GFP)处理和Hepa CAM过表达腺病毒(Ad-GFP-Hepa CAM)处理,CCK-8法检测Hepa CAM对细胞增殖的影响,q RT-PCR和Western blot法检测Hepa CAM对β-catenin、c-Myc和cyclin D1的m RNA和蛋白表达水平的影响。采用Wnt/β-catenin信号通路激活剂Li Cl处理T24细胞,MTT法检测细胞增殖能力,Western blot检测GSK3β(try216)磷酸化水平及β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平,克隆形成试验检测细胞的克隆形成能力。结果显示,过表达Hepa CAM后,能够抑制T24细胞的生长,下调β-catenin、c-Myc及cyclin D1的m RNA和蛋白的表达水平。5,10,20μmol/L的Li Cl作用细胞2 h后,均可促进T24细胞的增殖。10μmol/L的Li Cl作用2 h后能够降低GSK3β的磷酸化水平,促进Wnt信号通路的活化。10μmol/L的Li Cl与Ad-GFP-Hepa CAM联合处理细胞后,能够逆转Hepa CAM对β-catenin、c-Myc及cyclin D1蛋白水平和细胞增殖的抑制作用。该研究表明,Hepa CAM可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞T24的增殖。     

RNA干扰Mcl-1基因表达对淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的机制研究

目的:探讨抑制Mcl-1基因表达对淋巴瘤Raji细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法:NC-siRNA、Mcl-1-siRNA转染Raji细胞,以不作任何处理的细胞作为空白对照组,48h后Western blot检测各组细胞中Mcl-1的蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡情况;Western blot检测Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果:转染Mcl-1-siRNA后Mcl-1的蛋白表达显著降低;与对照组及NC-siRNA组比较,Mcl-1-siRNA组细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cleaved caspase3蛋白显著上调表达,Notch1和Hes1蛋白显著下调表达。结论:RNA干扰抑制Mcl-1基因表达可显著降低Raji细胞增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Notch1信号通路有关。     

EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移

EBP50通过抑制LIMK/cofilin信号通路和PI3K/Akt/m TOR/MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。然而,EBP50是否可以通过其他机制抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移尚未可知。本研究发现,EBP50能通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响乳腺癌细胞的侵袭和转移。Western印迹结果显示,EBP50在低转移细胞株MCF-7和正常乳腺细胞株MCF-10A中高表达,而在高转移细胞株MDA-MB-231低表达。采用RNAi技术将小RNA质粒瞬时转染乳腺癌细胞株MCF-7,同时将质粒pc DNA3.1-EBP50转入乳腺癌细胞株MDA-MB-231。Western印迹结果显示,Si EBP50/MCF-7细胞组的EBP50表达水平明显下调,MDA231/EBP50细胞组的EBP50表达水平明显上调。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示,用Wnt3a刺激后,Si EBP50/MCF-7细胞组体外迁移和侵袭能力明显增强,MDA231/EBP50细胞组体外迁移和侵袭能力明显减弱。Western印迹结果显示,与未用Wnt3a或同时用Wnt3a和抑制剂Dkk1刺激的相比,Si EBP50/MCF-7细胞组上皮-钙粘蛋白(Ecadherin)下调,波形蛋白(vimentin)上调,细胞核中β-联蛋白(β-catenin)的表达水平升高,而MDA231/EBP50细胞组上皮-钙粘蛋白上调,波形蛋白下调,细胞核中β-联蛋白表达下降。上述结果表明,EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响β-联蛋白的转核,抑制EMT的发生,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。     

LY294002对CML急变期细胞中Wnt／β-catenin信号通路的影响及其效应

β-catening在慢性粒细胞白血病急变过程中发挥着重要作用,而其受BCR／ABLTL其下游信号通路调控的具体分子机制尚未完全阐明。该研究旨在探讨PI3K-AK聪号通路对慢粒急变期细胞的影响及其对Wnt／β-catenin信号通路的调控作用。采用P13K-AKT信号通路的靶向抑制剂LY294002作用于慢粒急变期K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响,甲基纤维素克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,Western blot检测pAKT（Thr308）的表达变化,RT-PCR和Western blot分别检测β-catenin及其下游靶基因c—myc、cyclinD1的mRNA和蛋白表达情况。结果显示,10,20,40μmol/L的LY294002作用细胞24h后,抑制了K562细胞的增殖以及克隆形成能力。该效应呈浓度依赖的方式。3种浓度的LY294002处理细胞后,PI3K—AKT信号通路明显被抑制,pAKT（Thr308）的蛋白表达明显减少;β-catenin的mRNA表达无明显改变,但其蛋白水平依次减少;β-catenin的下游靶基因c-myc、cyclin D1的mRNA和蛋白水平均明显降低。综上所述,抑制PI3K-AKT信号通路可抑制白血病K562细胞的增殖和克隆形成能力,其机制可能与抑制Wnt／β-catenin信号通路相关。     

中心粒周蛋白对胰岛素分泌的调节作用及其机制

目的:探讨中心粒周蛋白(pericentrin,PCNT)对胰岛素双相分泌的调节作用及其机制。方法:构建在小鼠胰岛β细胞中PCNT表达减少的转基因鼠(△PCNTβ小鼠),检测△PCNTβ小鼠与正常对照小鼠在给予糖耐量试验后第一时相和第二时相血糖和胰岛素分泌情况。检测两组小鼠胰岛内PCNT、胰岛素、纤维肌动蛋白(F-actin)变化情况,以及相关蛋白表达情况。结果:Western blot和RT-PCR显示△PCNTβ小鼠胰尾组织PCNT表达较对照组明显减低,免疫荧光提示△PCNTβ小鼠胰岛内PCNT、胰岛素表达较对照组明显减低。行腹腔注射葡萄糖耐量试验(Intraperitoneal glucose tolerance tests,IPGTT)△PCNTβ小鼠第一时相血糖曲线下面积(Quantification of area under the curve,AUC)显著高于对照组,第二时相血糖AUC两组小鼠间无统计学差异。△PCNTβ小鼠空腹胰岛素水平与对照组比较明显升高,葡萄糖刺激胰岛素分泌(Glucose stimulated insulin secretion,GSIS)后15min胰岛素增加值显著低于对照组,30 min和120 min时胰岛素水平与对照组无显著差异。Western blot显示△PCNTβ小鼠与对照组比较F-actin表达明显减低,ERK、p-ERK表达明显升高。RT-PCR测定△PCNTβ小鼠与对照组比较ETV4表达显著升高。免疫荧光提示△PCNTβ小鼠胰岛内F-actin和突触融合蛋白4(Syntaxin4,Syn-4)表达较对照组明显减低。结论:抑制小鼠胰岛β细胞内PCNT表达后,其通过抑制F-actin和Syn-4表达影响胰岛素分泌,导致空腹时胰岛素过度分泌和第一时相胰岛素分泌受损。     

葡萄籽原花青素对人骨肉瘤143B细胞的作用及机制研究

该文研究葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins,GSP)对人骨肉瘤143B细胞增殖、凋亡的影响及其机制。用不同剂量GSP处理骨肉瘤143B细胞,结晶紫染色和集落形成试验分别用于检测细胞增殖和集落形成能力的变化;流式细胞术检测细胞周期与凋亡,Western blot法检测周期和凋亡相关蛋白;RT-PCR和Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达的变化;采用腺病毒Adβ-catenin感染以过表达β-catenin,探讨GSP抑制143B细胞增殖的作用是否与Wnt/β-catenin信号通路相关。结果显示,GSP在20~60μg/m L剂量范围内呈剂量和时间依赖性抑制143B细胞增殖活力和降低细胞克隆形成能力;GSP引起G0/G1周期阻滞和周期相关蛋白cyclin D1下调,还使细胞凋亡率明显增高,并伴有活化的凋亡相关蛋白cleaved PARP(poly ADP-ribose polymerase)和cleaved caspase-8的水平增高;GSP降低143B细胞中β-catenin m RNA水平及核内与总β-catenin蛋白质水平,抑制GSK3β磷酸化并上调GSK3β蛋白质水平;过表达β-catenin可部分减弱GSP对该细胞增殖活性的抑制作用。结果表明,GSP抑制骨肉瘤143B细胞的增殖和促进其凋亡,其机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的抑制。     

Wnt/β-catenin信号通路对细胞凋亡和坏死的调控研究进展

Wnt信号通路是一条与细胞增殖分化和机体平衡密切相关且高度保守的信号通路,主要包括Wnt/β-catenin信号通路、Wnt-Ca2+信号通路和平面细胞极性信号通路。其中,以经典Wnt/β-catenin信号炎性反应和细胞命运方面的研究最为深入。现已证实,Wnt/β-catenin信号对细胞命运的调控作用具有两面性,不仅通过调节Survivin、Cyclin、C-myc等基因的表达抑制一些肿瘤细胞凋亡,而且可通过上调促凋亡蛋白BIM、Bax和下调抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-xl的表达量来促进细胞凋亡。同时,该信号还可以通过抑制某些炎性因子的过度分泌,并下调活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量及坏死相关蛋白PARP-1的表达来抑制细胞坏死。该文对Wnt/β-catenin信号对细胞凋亡和坏死的调控研究进展进行综述。     

Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的影响

目的:研究Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对软骨细胞的作用探讨骨关节炎(OA)发生及进展的可能途径和分子机制。方法:β-catenin过表达慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,荧光显微镜观察病毒转染情况.Western blot方法:检测滑膜细胞核内β-catenin蛋白表达。Transwell小室共培养人滑膜细胞与正常人软骨细胞,倒置显微镜观察滑膜细胞对软骨细胞生长形态变化的影响。酶联免疫吸附(ELISA)法检测不同时间点共培养体系中软骨细胞培养上清液中MMP-7的变化找出MMP-7变化最明显的时间点。同时在最佳时间点ELISA方法:检测软骨细胞培养上清液CTX-Ⅱ、COMP的水平。结果:慢病毒转染滑膜细胞后茨光显微镜下可见多数滑膜细胞表达荧光.Western blot检测发现滑膜细胞胞浆及胞核中β-catenin表达明显上调(P0.01)。通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后,光镜下观察软骨细胞生长形态变化不明显,但随共培养时间的延长软骨细胞生长受到抑制胞体边缘发白壁强度降低。ELISA结果:显示通路活化的人滑膜细胞与软骨细胞共培养后软骨细胞上清液中MMP-7表达明显升高,与正常组相比有显著差异(P0.01)软骨细胞上清液MMP-7的变化有一定的时间依赖性在共培养2h、6h、12h时逐渐升高;24h时略有降低且在共培养6h时变化最为明显。而共培养6h时通路激活组软骨细胞培养上清液中COMP、CTX-Ⅱ水平与正常对照组相比均明显升高(P0.01)。结论:β-catenin过表达慢病毒转染正常人滑膜细胞可成功激活Wnt/β-catenin信号通路,Wnt/β-catenin信号通路活化的滑膜细胞可影响正常软骨细胞的生长,并引起滑膜-软骨体系内环境异常,促使软骨基质的降解这可能是滑膜炎促进OA发生、发展的机制之一。     

p38 MAPK介导高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转变

本文旨在观察p38MAPK与高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转变之间的关系。将雄性Sprague—Dawley（SD）大鼠随机分为对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组,用免疫组织化学、Western blot检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK（P—p38MAPK）蛋白表达。采用机械分离和酶消化获取SD大鼠肾小管节段,进行肾小管上皮细胞培养,将肾小管上皮细胞分为对照组、高渗组（20mmol／L D—mannitol）、高糖组（20mmol／L D—glucose）和SB202190（p38MAPK特异性抑制剂）＋高糖组,处理72h后收集细胞,用免疫细胞化学检测α-平滑肌肌动蛋白（α—smooth muscleactin,α-SMA）、p-p38MAPK和Snaill蛋白表达,Western blot检测p38MAPK、p-p38MAPK、Snaill、转化生长因子β1（transforming growth factor—β1,TGF-β1）、α-SMA和E-cadherin的表达,RT-PCR检测α-SMA和E-cadherin mRNA的表达。体内和体外结果均显示,高糖状态激活了p38MAPK,这种活化作用在体内可因胰岛素控制血糖而被消除,在体外可被p38MAPK特异性抑制剂SB202190显著抑制;高糖组α-SMA蛋白和mRNA在原代培养肾小管上皮细胞的表达较对照组分别增加12倍和8倍（P〈0．01）,SB202190处理组其表达则较高糖组分别减少67％和50％（P〈0．01）。SB202190不影响TGF—β1蛋白表达,但下调Snaill蛋白表达,并部分恢复高糖组E—cadherin蛋白和mRNA的表达。上述结果提示,p38MAPK可能通过转录因子Snaill介导高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转变。