φC31整合酶系统介导的位点特异性整合研究进展

来源于链霉菌(Streptomyces)噬菌体φC31的整合酶可介导链霉菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)之间的同源重组,这种重组亦可在多种动植物细胞内进行;而且,该整合酶还可介导含attB位点的载体以位点特异性方式整合于多种真核生物基因组内的假attP位点,并使转基因持续高效表达。因此,φC31整合酶在基因修饰、基因治疗及转基因动物研制等方面得到了广泛的应用。文章就近年来φC31整合酶整合规律、提高效率方面的改进及安全性等相关领域的研究进展进行了综述。     

高效位点特异性链霉菌ψC31噬菌体整合酶的研究进展

链霉菌ψC31噬菌体整合酶(ψC31-int)属于位点特异性重组酶的解离酶/转化酶系,该家族催化机制由丝氨酸介导,能识别噬菌体附着位点(attP)和宿主基因组上的细菌附着位点(attB),介导同源序列之间的位点特异性重组.实验证实,ψC31-int是一种高效位点特异性整合工具酶,与其他整合策略相比,具有集高效和安全于一体的优点,通过介导位点特异性整合,将外源基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效的表达,并且具有DNA容量方面的优势.随着研究的深入,人们对ψC31-int介导整合作用机制和影响因素有了进一步的认识.通过一系列成功应用ψC31-int进行的基因治疗的动物学实验,为今后如何利用非病毒载体系统进行基因治疗及转基因动物模型的建立提供了一种新的选择.     

高效位点特异性链霉菌φC31噬菌体整合酶的研究进展

链霉菌φC31噬菌体整合酶（φC31-int）属于位点特异性重组酶的解离酶／转化酶系,该家族催化机制由丝氨酸介导,能识别噬菌体附着位点（attP）和宿主基因组上的细菌附着位点（attB）,介导同源序列之间的位点特异性重组。实验证实,φC31-int是一种高效位点特异性整合工具酶,与其他整合策略相比,具有集高效和安全于一体的优点,通过介导位点特异性整合,将外源基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效的表达,并且具有DNA容量方面的优势。随着研究的深入,人们对φC31-int介导整合作用机制和影响因素有了进一步的认识。通过一系列成功应用φC31-int进行的基因治疗的动物学实验,为今后如何利用非病毒载体系统进行基因治疗及转基因动物模型的建立提供了一种新的选择。     

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨

高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.     

角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有角质细胞特异性角质素5启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因plyA的转基因载体pK5-Cre-hGH。以显微注射的方法将4．2kb的转基因片段K5-Cre-hGH引入小鼠基因组,共注射720枚受精卵,其中龄5枚移植至29只假孕母鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠48只,经基因型鉴定有12只小鼠在其基因组上整合有Cre基因,整合率为25％。将带有cre重组酶基因的小鼠与基因组上携带loxP位点的smad4条件基因打靶小鼠杂交以检测Cre重组酶组织特异性表达情况以及介导重组的功能。结果表明,K5-Cre转基因小鼠只在皮肤组织中表达Cre重组酶并能在体内成功地介导loxP位点的重组。     

ΦC31位点特异性整合酶DNA结合功能域的鉴定

DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定ΦC31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对ΦC31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用PCR和克隆技术在pET22b原核表达载体上构建ΦC31整合酶重组截短突变体表达质粒,将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达,经镍柱纯化获得了纯度达90%以上的重组蛋白,分子量也与预期大小一致,Western印迹确定了重组蛋白的特异性.凝胶迁移滞后实验显示野生型以及截短突变体蛋白ΦC311-528、ΦC311-472、ΦC311-413能与细菌附着位点DNAattB和噬菌体附着位点DNAattP结合的条带,而截短突变体ΦC311-353、ΦC311-279、ΦC311-120观察不到相应的结合条带.6个截短突变体质粒在体内重组活性蓝白斑实验中均表现为蓝斑,显示出皆丧失体内重组活性.研究证实,ΦC31整合酶半胱氨酸富集域(第353～413位氨基酸)具有DNA结合的功能,而C末端缬氨酸富集区(第528～613位氨基酸)也与其重组活性相关.这为进一步了解ΦC31整合酶的结构与功能,最终引导其结构进化,提高其特异性和整合效率奠定了基础.     

卵母细胞特异表达φC31整合酶载体pZP3-INT的构建及其在小鼠卵母细胞中的表达

链霉菌噬菌体φC31整合酶是一种位点特异性重组酶(Site-specific recombinase,SSR),可介导链霉菌噬菌体attP位点(Phage attachment site)和链霉菌基因组attB位点(Bacterial attachment site)间的单向重组.为探讨它能否应用于卵母细胞特定基因的重组,文章采用卵巢针刺取卵法采集生发泡(GV)期小鼠卵母细胞,将卵透明带糖蛋白3(ZP3)启动子驱动φC31整合酶表达载体pZP3-INT和检测φC31整合酶位点特异性重组功能的重组质粒载体pBCPB+,通过显微注射导入到小鼠卵母细胞中.培养48 h后,RT-PCR检测φC31整合酶mRNA表达以及PCR检测pBCPB+载体发生重组的情况.结果表明:载体pzP3-INT在卵母细胞中表达φC31整合酶mRNA;并且pBCPB+载体发生了位点特异性重组,提示φC31整合酶在卵母细胞中可以介导位点特异性重组反应.     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

消化道细胞表达Cre重组酶转基因小鼠的功能鉴定

目的:检测白蛋白启动子介导的Cre重组酶转基因小鼠Alb-Cre-2中Cre重组酶的组织分布及其在体内介导基因重组的作用。方法:将Alb-Cre小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配,利用PCR对Cre重组酶介导重组的组织特异性进行检测;然后,将Alb-Cre-2转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配,利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测。结果:PCR结果显示心、肺、胰、脑及消化道中Cre重组酶介导的Smad4基因发生重组;LacZ染色进一步表明Cre重组酶在肝细胞、胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞、大肠柱状细胞及空泡细胞中特异性表达,并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。结论:Alb-Cre-2转基因小鼠在消化道中具有一定的组织特异性,只在胃壁细胞、空肠潘氏细胞、回肠杯状细胞、大肠杯状细胞,大肠柱状细胞及空泡细胞等细胞类型中特异性表达,并能在体内成功地介导这些消化道上皮细胞基因组上LoxP位点间的重组,是一种研制在消化道特定细胞中特异性基因剔除小鼠的良好工具小鼠。     

Sp100与HIV-1整合酶互作并抑制其介导的病毒整合

Sp100是核颗粒ND10的组成蛋白,在哺乳动物细胞中广泛存在．Sp100参与多种细胞生理病理过程,如转录调控、细胞内抗病毒免疫等．利用酵母双杂交系统,我们发现了Sp100的互作蛋白HIV-1整合酶,免疫共沉淀实验进一步证实了Sp100与 HIV-1整合酶的互作,细胞内荧光共定位实验也证实了二者在细胞内部分共定位．此外,突变体实验表明,Sp100的C端300～480氨基酸和HIV-1的催化结构域是两个蛋白质的互作区域．利用siRNA降低细胞内Sp100的表达量,可以增加HIV-1整合酶介导的病毒的整合,反之,细胞内过表达Sp100则会降低HIV-1整合酶介导的病毒的整合．这是首次发现Sp100可以和HIV-1整合酶发生相互作用,并进而抑制病毒的整合．我们发现了Sp100作为HIV-1整合酶互作蛋白的新功能,并扩展了细胞防御病毒感染的相关研究．     

Daxx通过上调caveolin-1的表达介导Ox-LDL诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡

为探讨Daxx对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)诱导巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡的介导作用及其可能的分子机制,用高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量,油红O染色观察细胞内脂滴的形成情况,流式细胞术和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法研究Ox-LDL对细胞凋亡的影响,Real time RT-PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达水平,Western blot检测caveolin-1蛋白的表达,用特异性siRNA沉默Daxx在RAW264.7 细胞中的表达．Ox-LDL上调Daxx mRNA和caveolin-1的表达、增加细胞内胆固醇含量、促使RAW264.7细胞凋亡,用特异性siRNA干扰Daxx在RAW264.7细胞中的表达能降低caveolin-1的表达、减少细胞内胆固醇含量、以及抑制细胞凋亡．上述结果表明,Daxx对Ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积和凋亡具有介导作用,这一作用可能与Daxx上调caveolin -1的表达有关．     

基于Flp重组酶介导的盒式交换HPRT位点定点转基因研究

以电穿孔转染法将构建的交换质粒pF-HPRT-F3和Flp表达载体pCMV-Flp共转染已在基因组HPRT位点整合有交换盒F-Neo-F3结构的ES细胞F18,经HAT筛选得到HAT抗性ES细胞克隆;G418敏感性试验和基因组Southern杂交表明,所分析的12个HAT抗性克隆中有3个克隆发生了预期的盒式交换重组,转基因定点整合的相对效率为25%.这一结果表明,Flp重组酶是可以在HPRT位点有效地介导盒式交换反应的,我们提出的利用Flp重组酶介导的盒式交换反应建立基于HPRT位点的转基因定点整合体系的策略是可行的.     

卵母细胞特异表达ФC31整合酶载体pZP3－INT的构建及其在小鼠卵母细胞中的表达

链霉菌噬菌体ФC31整合酶是一种位点特异性重组酶（Site—specific recombinase,SSR）,可介导链霉菌噬菌体attP位点（Phage attachment site）和链霉菌基因组attB位点（Bacterial attachment site）闻的单向重组。为探讨它能否应用于卵母细胞特定基因的重组,文章采用卵巢针刺取卵法呆集生发泡（GV）期小鼠卵母细胞,将卵透明带糖蛋白3（ZP3）启动子驱动的ФC31整合酶表达载体pZP3－INT和检测qbC31整合酶位点特异性重组功能的重组质粒载体pBCPB^＋,通过显微注射导入到小鼠卵母细胞中。培养48h后,RT-PCR检测ФC31整合酶mRNA表达以及PCR检测pBCPB^＋载体发生重组的情况。结果表明：载体pZP3-INT在卵母细胞中表达ФC31整合酶mRNA;并且pBCPB^＋载体发生了位点特异性重组,提示ФC31整合酶在卵母细胞中可以介导位点特异性重组反应。     

含FLP“交换盒”结构的打靶载体构建及ES细胞打靶研究

利用小鼠HPRT基因组DNA片段和人工合成的含有FLP重组酶识别位点变异体FRT和F3RT序列的寡核苷酸 ,构建了针对小鼠HPRT基因位点的置换型打靶载体pSP HPRT Fneo F₃。经过限制酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后 ,将线性化了的打靶载体以电穿孔法导入ES细胞内 ,经G418和 6 -TG双药筛选和分子鉴定 ,得到了 2个在HPRT位点整合有FLP重组酶“交换盒”F Neo F3结构的双交换重组ES细胞克隆 ,为建立基于FLP重组酶介导的盒式交换的高效、定点转基因体系创造了条件.     

Cre-loxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价

选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP). 经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系. 将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选（FACS）、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1 %,DNA水平的删除效率则达到97 %.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据.     

软骨组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的研制和鉴定

构建了含有软骨组织特异性Ⅱ型胶原A1启动子和Cre重组酶基因的转基因载体pcol2Al-Cre。323枚小鼠受精卵经显微注射引入转基因片段后,分别移植至14只假孕母鼠的输卵管使其发育。共得到仔鼠52只,PCR结果显示其中10只小鼠基因组上有Cre基因的整合,整合率为19．2％。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,以检测Cre酶介导的重组及其组织特异性。PCR结果表明：col2Al-Cre转基因小鼠软骨组织中表达的Cre重组酶成功地介导了LoxP之间的重组。此结果通过Southern杂交得到了进一步的证实。     

卵母细胞特异表达fC31整合酶载体pZP3-INT的构建及其在小鼠卵母细胞中的表达

链霉菌噬菌体fC31整合酶是一种位点特异性重组酶(Site-specific recombinase, SSR), 可介导链霉菌噬菌体attP位点(Phage attachment site)和链霉菌基因组attB位点(Bacterial attachment site)间的单向重组。为探讨它能否应用于卵母细胞特定基因的重组, 文章采用卵巢针刺取卵法采集生发泡(GV)期小鼠卵母细胞, 将卵透明带糖蛋白3(ZP3)启动子驱动的fC31整合酶表达载体pZP3-INT和检测fC31整合酶位点特异性重组功能的重组质粒载体pBCPB⁺, 通过显微注射导入到小鼠卵母细胞中。培养48 h后, RT-PCR检测fC31整合酶mRNA表达以及PCR检测pBCPB⁺载体发生重组的情况。结果表明: 载体pZP3-INT在卵母细胞中表达fC31 整合酶mRNA; 并且pBCPB⁺载体发生了位点特异性重组, 提示fC31整合酶在卵母细胞中可以介导位点特异性重组反应。     

中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠

利用从129sv小鼠基因组文库克隆得到的1．8kb的胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)基因的5′端调控序列,构建了含有2个β—珠蛋白绝缘子、GFAP5′端调控区、Cre基因和人生长激素基因(hGH)polyA的转基因载体pGFAP—Cre—hGH。以显微注射的方法将7．6kb的转基因片段pGFAP—Cre—hGH引入191枚小鼠基因组受精卵,其中176枚分别移植至8只假孕母鼠的输卵管中使其发育,共获得子代小鼠25只。经PCR和Southern杂交鉴定其中7只小鼠基因组上整合有Cre基因,整合率为28％。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上整合有LoxP位点和LacZ表达框的ROSA26鼠杂交,以检测Cre酶的活性、组织特异性及其介导的两个LoxP位点间的重组。LacZ染色结果表明,GFAP—Cre转基因小鼠只在中枢神经系统中表达Cre重组酶并能在体内成功介导LoxP位点间的重组。     

Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性条件敲除研究的关键。采用PCR扩增大鼠胰岛素基因705bp启动子指导发胰岛细胞中特异表达;同时采用改构的Cre重组酶基因,在其5'端添加有真核核糖体结合序列和核定位序列使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核能发挥功能;同时,为了保证原核基因Cre能在真核系统顺利表达,在其3'端添加含内含子的人生长激素基因。构建的表达载体在去除原核序列后用显微注射方法转基因小鼠,在出生的27只仔鼠中,PCR检测共获得7只Cre整合阳性的转基因小鼠,整合率26％。这种Cre转基因小鼠与基因组小携带LoxP位点的条件基因打靶小鼠交配,在胰腺组织中可以检测到Cre介导的重组,表明Cre在转基因小鼠胰腺中有表达。     

φC31整合酶与转基因动物研制

链霉菌噬菌体φC31整合酶是一种位点性特异重组酶.它以单向整合方式进行重组,无须其他辅助因子,且整合效率高、表达稳定,所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合,并被应用于哺乳动物的转基因整合技术中,它为攻克转基因动物研制过程中的随机整合、整合效率低、表达水平不高等技术瓶颈提供了新思路.对链霉菌噬茵体φC31整合酶的作用机制和特点优势作了简要的阐述,并对其广阔的应用前景作一展望.