帕金森病相关蛋白质LRRK2在脑中的表达分布与定位分析

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种最常见的神经退行性运动障碍,常染色体显性遗传PD可由LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2)基因突变引起.原核表达和纯化得到LRRK2多肽与GST的融合蛋白,免疫新西兰雄兔,得到了anti-LRRK2兔多克隆抗体. 抗体用途分析实验表明,自制的anti-LRRK2兔多克隆抗体可用于Western 印迹, 免疫组织化学,免疫细胞染色等实验.利用自制的抗体,Western 印迹证明,LRRK2在大鼠脑主要神经解剖学部位均有表达.免疫荧光双染色的结果表明,LRRK2定位于线粒体.本研究对了解LRRK2在PD中的分子生物学功能具有重要的意义.     

深度突变扫描技术在蛋白研究中的应用

作为细胞结构与功能的中心参与者,蛋白质一直是生命科学研究的中心主题。分析蛋白质序列变异对其结构、功能的影响,是研究蛋白的重要手段之一。近年一种称为深度突变扫描(deep mutational scanning,DMS)的技术被广泛应用于蛋白研究领域,其通过高丰度DNA文库在蛋白特定区域平行引入成千上万种突变,经筛选后,利用高通量测序为每一种突变打分,从而揭示序列与功能之间的相关性。深度突变扫描以其高通量、快速简易、节省人工等特点,已经成为蛋白质功能研究以及蛋白工程改造的一种重要方法,目前已在蛋白进化、抗体改造、致病突变鉴定等蛋白研究的多个领域广泛应用。本综述简要概括了深度突变扫描技术的原理,重点介绍了其在哺乳动物细胞中的应用,同时分析了目前的技术瓶颈,旨在为相关研究提供参考。     

药物分子伴侣: 蛋白质折叠运输缺陷的新疗法

大量遗传性疾病的发生是由于基因突变引起蛋白质错误折叠而不能运输到作用位点,从而导致功能缺陷．近年来兴起的药物分子伴侣是恢复蛋白质折叠运输缺陷的新疗法,这类化合物一般为目的蛋白的底物类似物、受体配基或酶抑制剂等化学小分子,具细胞通透性,能在内质网中特异性识别并结合突变蛋白,校正并稳定其正确构象,协助其运输到正确位点,直接恢复突变蛋白功能,可治疗各种南蛋白质折叠运输缺陷导致的内分泌及代谢疾病．目前已报道的由药物分子伴侣恢复功能的突变蛋白主要为质膜蛋白及细胞器蛋白,如ATP结合盒转运蛋白、G-蛋白耦联受体及溶酶体酶等．大量的细胞及动物实验结果显示了药物分子伴侣的临床应用前景广阔,目前已有一例临床实验获得了成功．     

应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法检测LRRK2基因的单核苷酸多态性

目的：应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法（Adapter Ligation—mediated Allele-specific Amplification,简称ALM-ASA）技术,检测与帕金森病（PD）发病相关的LRRK2基因中的4个SNP位点（6055G〉A,7153G〉A,4321C〉T和2264C〉T）,探讨该法用于筛查帕金森病相关SNP位点的可行性,研究多个SNP住点同时检测的准确性和可靠性。方法：运用ALM—ASA法原理,改进使用多重PCR法代替单一预扩增法,使用4对引物在单管中预扩增含所待测SNP位点的四段片段,通过酶切、酶连和PCR特异性扩增检测判断SNP的类型。经PCR体外定点突变实验制备的相应位点的突变阳性片段,检验方法的准确性和可靠性。结果：采用该法成功测定了20名PD病人和20名健康中国人的LRRK2基因中最受关注的4个SNP位点的多态性。并随机对其中10分样本的检测结果以测序法检测进行验证,结果完全一致。结论：ALM-ASA法极大提高了PCR反应的特异性,是一种准确、可靠,且费用低廉的SNP筛查方法,可推广应用于临床和实验室进行与PD有关的单核苷酸多态性的筛查检测。     

帕金森病患者脑脊液蛋白质组学分析

帕金森病（Parkinson′s disease,PD）是一种中枢神经系统慢性进展性疾病.本研究采用双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）分离脑脊液（cerebrospinal fluid,CSF）蛋白,获得2-DE图谱,通过ImageMaster 2D Elite软件分析寻找两组的差异蛋白点.结果显示,PD患者CSF中有4个蛋白点丰度下降,22个蛋白点丰度上升.还利用电喷雾质谱（electrospray ionization-tandem mass spectrometric,ESI-MS）对差异蛋白点进行鉴定,发现丰度上升的蛋白点有电压依赖性钙通道α2/δ1亚基,结合珠蛋白,β2-微球蛋白和阿朴脂蛋白A-IV前体,丰度下降的蛋白点为转铁蛋白和转甲状腺蛋白.研究发现,PD患者与对照组CSF蛋白质表达有明显差异,对差异蛋白进行质谱鉴定并了解它们的功能,为以后进一步研究他们在PD发病机制和病程进展中的作用奠定基础.     

帕金森病相关基因功能研究进展

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种较为常见的锥体外系疾病,主要症状是运动减少、肌强直和震颤;主要病理特征是黑质致密区多巴胺神经元缺失,剩余神经元含有Lewy小体。PD的发病机制尚未完全清楚,一般认为与年龄及环境因素相关。近年来PD遗传学研究取得了长足的进步,确定了遗传因素在PD发病过程中的重要作用,发现并鉴定了多个与帕金森病相关的基因:SNCA、LRRK、PINK1、parkin、DJ1和UCHL1等。文章对上述相关基因的功能研究进展进行综述,为进一步探讨PD发病机制提供参考。     

钠离子通道β4亚基糖基化的初步研究

异常表达的糖蛋白与PD等多种神经退行性疾病有关。糖蛋白组学研究发现,电压门控钠离子通道β4亚基在PD病人脑组织中表达明显增加。为了深入探索β4亚基及其糖链在帕金森发生发展中的作用,采用PD转基因鼠对其表达进行验证,对其潜在的糖基化位点进行定点突变,构建重组表达质粒。结果发现,在新生PD转基因鼠和野生成鼠脑组织中有~38kDa蛋白条带表达,而在新生野生鼠脑组织中不表达;用PNGase F酶处理去除糖链后,~38kDa蛋白条带变成迁移速递更快的较小分子量条带,说明β4亚基是高度糖基化的蛋白,并且其糖基化与生长发育有关。将突变重组质粒转入HEK-293细胞和小鼠神经瘤细胞Neuro2A中表达,结果发现突变型质粒分子量明显低于野生型。为研究β4亚基及其糖链的功能提供了一定的实验数据并打下了基础。     

蛋白质组学技术筛选和鉴定白化黑线仓鼠皮肤白化相关差异蛋白质

目的比较黑线仓鼠及其白化突变系背部皮肤蛋白表达的差异,寻找差异蛋白质,从蛋白质水平探讨白化病的发生机制。方法应用双向凝胶电泳技术分离出差异蛋白质,用质谱法分析其结构与组成,通过蛋白质数据库确定差异蛋白的功能。结果从64个表达差异蛋白斑点中发现33个显著差异的蛋白点,其中又有14个差异点匹配到了有意义的蛋白质。14个差异点共鉴定出11个差异蛋白质,这些差异蛋白质按功能可分为4类:(1)糖代谢相关蛋白;(2)运输蛋白;(3)细胞骨架蛋白;(4)其他蛋白。结论黑线仓鼠与其白化突变系背部皮肤蛋白表达存在明显差异,其中一些蛋白与白化病发生相关,并可能成为白化病致病机理研究的分子标志物和药物治疗靶向位点。     

中国荷斯坦牛ABCG2基因编码区多态性检测及生物信息学分析

目的：研究中国荷斯坦牛ABCG2基因编码区（CDS）多态性,并进行生物信息学分析。方法：以中国荷斯坦牛为材料,利用PCR-SSCP技术对ABCG2基因CDS多态性进行检测,然后预测蛋白质序列的改变,并用生物信息学软件对蛋白质序列突变前后的结构及性质进行分析。结果：在外显子9中存在一个A→G碱基突变,导致氨基酸由酪氨酸突变为半胱氨酸,将此突变命名为Y367C;在外显子14中存在一个G→A突变,导致氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺,将此突变命名为R578Q。2个突变一个位于功能区与跨膜区之间,一个位于跨膜区。生物信息学分析发现,蛋白质二级结构增加了1个卷曲（C）和2个转角（T）,同时减少了3个β折叠（E）,且ABCG2蛋白的组成和一些性质也发生了改变。结论：检测到的2个单核苷酸多态性引起了ABCG2蛋白性质和二级结构的改变;为进一步研究ABCG2蛋白对产乳性状的影响奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌致死因子突变株K518E和L519C的筛选及活性分析

为研究炭疽毒素致死因子( lethal factor,LF)致死机理,更有效地防治炭疽,对LF基因1 550～2 324 bp之间的片段进行了随机突变实验．通过细胞毒性实验筛选LF突变体库,结果获得5株活性降低突变体．进一步对单点突变体蛋白进行亲和纯化,首次得到了K518E、L519C两种突变蛋白,对其进行纯蛋白活性检测和竞争抑制实验,发现这两种突变蛋白活性显著降低,表明518位赖氨酸和519位亮氨酸对LF功能起着非常重要的作用．并且发现,K518E对野生型LF具有一定的抑制作用,对LF作用机理的研究有一定帮助．     

Bacillus subtilis自然感受态缺陷株蛋白质表达谱的初步分析

利用蛋白质双向电泳对枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株BR151pm感受态形成期的全细胞蛋白质进行比较分析,发现有28个蛋白质斑点出现变化。利用基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱对其巾2个明显缺失的蛋白斑点进行分析鉴定,确定这2个蛋白质分别为直接参与自然感受态形成的Nin蛋白和RecA蛋白,进一步确证了BR151pm为自然感受态缺陷突变株。     

Bacillus subtilis自然感受态缺陷株蛋白质表达谱的初步分析

利用蛋白质双向电泳对枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株BR151pm感受态形成期的全细胞蛋白质进行比较分析,发现有28个蛋白质斑点出现变化。利用基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱对其巾2个明显缺失的蛋白斑点进行分析鉴定,确定这2个蛋白质分别为直接参与自然感受态形成的Nin蛋白和RecA蛋白,进一步确证了BR151pm为自然感受态缺陷突变株。     

Bacillus subtilis自然感受态缺陷株蛋白质表达谱的初步分析

利用蛋白质双向电泳对枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株BR151pm感受态形成期的全细胞蛋白质进行比较分析,发现有28个蛋白质斑点出现变化。利用基质辅助激光解析/电离串联飞行时间质谱对其巾2个明显缺失的蛋白斑点进行分析鉴定,确定这2个蛋白质分别为直接参与自然感受态形成的Nin蛋白和RecA蛋白,进一步确证了BR151pm为自然感受态缺陷突变株。     

基于氨基酸序列预测蛋白质功能性点突变位点

突变是研究蛋白质结构和功能的重要方法。点突变实验中,突变位点的选择随机性大,若能对突变后蛋白质功能是否发生变化做出预测,将大大减少实验的盲目性。为此,作者设计了一个基于信号处理的单点替换突变预测模型,对序列上每个位点所有可能的氨基酸替换的效果进行估计。使用蛋白质突变数据库(Protein Mutant Database,PMD)里的11个蛋白共2600多个点突变的数据集,对以上模型进行了验证。结果表明正确率高达81.2%,并且推荐出的替换选择位点仅占所有可能替换突变的3.1%。在体外定点突变实验中,使用本模型推荐的高可能性功能突变位点将有助于提高实验的成功率。该模型使用蛋白质的氨基酸序列信息,特别是对未知结构的蛋白质同样适用。然而,由于缺乏足够的突变实验数据,本模型的应用仍需进一步完善和验证。     

利用重叠PCR技术对OsAMT1.2进行定点突变

铵是植物吸收利用的主要氮源之一,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用.为了深入研究水稻铵转运蛋白的结构功能特性,利用重叠PCR技术对OsAMT1.2蛋白质序列中保守的253 aa和257 aa的苯丙氨酸(F)和丝氨酸(S)分别突变为丙氨酸,成功获得了相应的2个点突变基因.因此,重叠PCR技术是一种简单有效的进行体外基因重组和突变的方法,对于研究高等植物功能基因的结构功能特性具有重要的意义.     

GBA突变与帕金森病的研究进展

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种黑质致密部多巴胺能神经元广泛变性,以及弥漫性路易体沉积的常见神经退行性疾病。PD发病的遗传因素不可忽视。研究表明,GBA突变是PD发病最大的遗传风险因素。戈谢病(Gaucher disease,GD)是由GBA突变引起其编码的葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GCase)功能缺失导致的一种溶酶体储存障碍疾病。部分GD病例出现PD的临床表现,且PD病例中GBA突变的频率明显增加,提示了GBA突变与PD的密切联系。携带GBA突变的PD病例发病更早,且GBA突变能够增加PD病例认知障碍的风险。虽然大量研究提示了GBA突变导致的GCase功能障碍干扰α-突触核蛋白的降解,而在PD疾病状态下异常的α-突触核蛋白可抑制正常的GCase功能并由此导致恶性循环,但关于GBA突变与α-突触核蛋白相互作用的确切机制仍未完全明确。本综述旨在总结GBA突变与PD发生和发展的潜在联系,希望对进一步发现PD发病机理和防御机制有所帮助。     

蛋白质突变库高通量表达筛选方法的研究

人工进化方法被越来越多地应用于重组蛋白的表达筛选及其结构功能的研究,在适当的选择压力下,它可以有效地改善野生型蛋白固有的低表达和低稳定性等问题。本研究就如何进行快速、有效的蛋白质人工进化以提高重组蛋白表达量,进行了方法学探索,通过建立以绿色荧光蛋白为报告基因、结合流式细胞仪分选和96孔板等高通量筛选方法,成功地进行了一例高通量蛋白质点突变库重组表达株的筛选。     

樟子松突变丛生枝蛋白质的双向电泳分析

目的：研究樟子松突变丛生枝的发生机理。方法：对其正常枝和突变丛生枝进行蛋白质双向电泳,通过ImageMaster2-DE计算机分析系统对结果进行定性、定量分析。结果：共有59个蛋白点在表达的质和量上有变化,其中35个蛋白点在突变丛生枝2-DE图谱中表达量均高于正常枝的蛋白点,20个蛋白点在突变丛生枝2-DE图谱中表达量均低于正常枝的蛋白点,4个蛋白点在突变丛生枝图谱上发生缺失。结论：差异表达的蛋白点可能与突变丛生枝的发生有关。     

应用iTRAQ定量蛋白质组学研究海分枝杆菌mkl的基因功能

【目的】通过分离海分枝杆菌野生株和mkl突变株的全菌蛋白,并进行差异蛋白质组分析,以期为探索分枝杆菌重要毒力基因mkl的功能提供新思路。【方法】以海分枝杆菌野生株和mkl突变株为研究材料,提取全菌蛋白,i TRAQ试剂标记后进行质谱鉴定和定量分析,并利用Uni Prot数据库对差异蛋白进行生物信息学分析。【结果】共鉴定出在野生株和mkl突变株中差异表达蛋白566个,其中在突变株中上调表达蛋白232个(比值≥1.4),下调表达蛋白334个(比值≤0.7)。生物信息学预测这些蛋白主要参与细菌脂质代谢、细胞壁和细胞进程、中间代谢、呼吸作用等生物学功能。其中Des A3下调最显著,其功能为脂肪酸去饱和酶,与油酸合成相关,进一步验证发现mkl突变株在不含油酸的固体培养基中生长受限,提示mkl可能在油酸的生物合成通路中发挥功能。【结论】通过i TRAQ分析了海分枝杆菌mkl突变株和野生株的差异表达蛋白谱,发现可能影响分枝杆菌油酸、脂质等合成代谢通路,为进一步研究mkl基因在分枝杆菌致病中发挥作用的相关机制奠定了基础。     

一种快速构建基因多个点突变体方法的建立

蛋白质内部多个位点的翻译后修饰在基因的功能调节过程中发挥重要作用,基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用,因此,高效、快速构建基因的多个点突变体在基因的功能研究中意义重大．本研究在建立了对目的基因进行高效准确的单点突变方法的基础上,以SRrp53点突变体的构建为例,设计了新型的以反向PCR为基础的多个点突变的实验流程,获得的多位点突变体质粒经测序后均与预期相符,将测序正确的多位点突变体质粒转染293T细胞后,均表达了分子质量正确的蛋白质．以上结果表明,该实验设计方案能够高效、方便地用于基因多个点突变体的构建,为进一步研究它们的分子功能打下了基础．