杀雄剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育小花完整叶绿体差异蛋白质组学的鉴定

为了在蛋白质水平揭示小麦雄性不育的分子遗传机制,以小麦经杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系,以及对应正常可育系所构建的等生理差异系为试材,应用差速离心和蔗糖密度梯度离心,首先分离出供试材料小花的完整叶绿体,制备蛋白样品后采用固相IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对完整叶绿体蛋白质进行了分离、银染,得到了重复性较好的双向电泳图谱．PDQuest 2DE软件分析识别出约150个较为清晰的蛋白质点,采用MALDI-TOF鉴定出的6个差异表达蛋白质分别是：PAP-fibrillin、ATRABB1A、底物同源结构域蛋白/Rho GAP结构域蛋白、铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、R2R3-MYB转录因子及1个假定蛋白质．生物信息学功能分析暗示,这些蛋白直接参与了花药内激素调节、蛋白质转运、蛋白质互作、活性氧积累及花药的发育,表明SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育其败育机理可能就与这些生理代谢过程的变异直接相关．     

小麦遗传型与生理型雄性不育花药蛋白质双向电泳分析

为了研究小麦雄性不育蛋白表达机制, 以具有异质同核的3个亲本: 即遗传型不育系ms(S)-西农1376、对应的保持系(A)-西农1376和生理型(化学杀雄剂SQ-1诱导)雄性不育系ms(A)-西农1376为材料, 利用IEF/SDS-PAGE凝胶电泳技术, 对发育到单核后期的花药全蛋白特异性进行了比较分析, 得到320~350个清晰的蛋白点。结果表明: 遗传型和SQ-1诱导的生理型不育系蛋白质图谱与正常保持系在蛋白质(多肽)表达量上存在一定的差异, 同时发现有几种蛋白质的表达有明显的特异性, 两个不育材料2D胶上共有几个明显的特异蛋白点, 而在保持系中未发现; 两个不育材料又分别具有自己的特异蛋白表达, 不育机理不同; 比较分析可知, 不育系中某些蛋白的表达受到了抑制, 并开启了与花药败育有关的特定蛋白的表达, 可能使物质能量代谢受阻,导致雄性不育的发生。     

化学杂交剂诱导的小麦生理型雄性不育花药的活性氧代谢

以化学杂交剂SQ-1诱导的生理型小麦雄性不育及其对照植株花药为材料,研究了不同花粉发育时期花药中超氧阴离子(O-·2)生成速率、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量以及主要抗氧化酶活性的变化,以探明小麦花药活性氧代谢和生理型雄性不育的关系.结果表明,在幼穗时期,O-·2生成速率、H2O2和MDA含量、超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均高于相应对照,而过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性则低于或显著低于对照;在单核早期以及花粉败育主要发生期(单核后期和二核初期),O-·2生成速率、H2O2和MDA含量极显著高于对照,而SOD、POD、CAT和APX酶活性却极显著低于对照;在败育后的花药中,O-·2生成速率和H2O2含量与对照之间差异幅度缩小,但MDA含量依然加大,同期的几种抗氧化酶活性依然极显著低于对照.在败育的关键期,品种'西农1376'处理株花药的活性氧升高幅度比'西农2611'处理株较大,抗氧化酶活性降低幅度也较大,且'西农1376'处理株的相对雄性不育率也较高.可见,化学杂交剂SQ-1能诱导小麦花药中O-·2和H2O2大量积累以及SOD、POD、CAT和APX活性的极显著降低,引起花粉关键败育期花药活性氧代谢严重失衡和严重膜脂过氧化,导致大量花粉母细胞发育受到严重抑制,最终造成小麦生理型雄性不育.     

基因芯片分析杀雄剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育的基因差异表达

为揭示小麦生理型雄性不育的分子机理,更好地为小麦杂种优势利用提供理论依据和技术支撑,本研究以SQ-1诱导的西农558生理型雄性不育的花药为试验材料,以未经SQ-1处理的西农558的花药为对照,利用基因芯片技术对两者的基因表达差异进行了分析,并对部分基因运用半定量PCR技术进行了验证.结果表明,在55 052个转录本中, 两材料间差异表达的转录本有2 052条, 其中1 294个基因表达上调,758个基因表达下调.功能分类表明这些基因主要参与了毒性物质响应、逆境响应、多糖代谢及信号转导等重要生命过程.为验证芯片数据的可信性, 利用cDNA半定量 PCR 法对11个差异表达显著的基因(Ta.116, Ta.5629, TaAffx.122333, Ta.30726, Ta.13682, Ta.4057, Ta.4101, Ta.4139, Ta.11957, Ta.25934, Ta.27552) 进行验证.结果证明,无论是上调表达的还是下调表达的基因,其表达模式都与基因芯片的检测结果的一致.这些基因可作为育性相关候选基因开展下一步研究.     

粘类非1BL/1RS小麦CMS基因定向选择及其育性特性的研究

对携有不同不育基因的4个粘类小麦雄性不育系进行了定向选择与鉴定,并对其育性特性进行研究,以选育更具应用价值的粘类非1BL/1RS小麦雄性不育系,推动三系杂交小麦的实际应用.结果表明:(1)根尖体细胞随体鉴定和A-PAGE技术分析筛选出的SP4、莫迦小麦为非1BL/1RS类型,其它供试不育系均属于1BL/1RS类型;(2)减数分裂及成熟花粉粒形态观察,粘类非1BL/1RS小麦雄性不育系其不育性是在整个配子发育过程中连续产生的,且在B型不育细胞质背景下,SP4和莫迦小麦的花粉细胞学形态与在K、Ven型2种不育细胞质背景下的不同,B型不育细胞质背景下SP4和莫迦不育系的花粉萌发率比K、Ven型不育细胞质背景下的花粉萌发率高;(3)以不同来源不育基因培育成的粘类K、Ven型非1BL/1RS不育系育性恢复性测定发现,SP4、莫迦小麦2种雄性不育系育性恢复性有一定差异,莫迦小麦不育类型育性恢复性高于SP4.     

小麦质核互作型雄性不育系及其保持系花药差异蛋白质组学分析

为了能从蛋白质水平揭示小麦细胞质雄性不育的分子遗传机制,采用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术,对小麦质核互作型雄性不育系(S)-1376A及其保持系(A)-1376B在花药发育的单核期、二核期蛋白质进行了差异蛋白质组学研究,经考马斯亮蓝染色,得到了重复性较好的双向电泳图谱．PDQuest 软件在分子质量9.0～100.0 ku、等电点4～7 线性范围内,可识别约610个蛋白质点,对28个差异表达的蛋白质点采用基质辅助激光解吸分离飞行时间质谱进行肽指纹图谱分析,并利用Mascot 软件在NCBInr数据库搜索,鉴定出12个差异表达蛋白,其中5个差异表达蛋白可能与雄性不育有关,分别是泛素结合酶E2、甘氨酸富集蛋白、抗坏血酸过氧化物酶、假定半胱氨酸蛋白酶抑制剂及1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小链克隆512,它们参与了物质能量代谢、细胞程序化死亡及花发育调控等过程,推测不育系(S)-1376A 雄性不育性可能与这些生理生化代谢有关．研究结果为揭示雄性不育机理提供了理论依据．     

两个育性相关基因在几类小麦雄性不育材料中的表达研究

以1B/1R类K型不育系K3314A及其保持系3314B,非1B/1R类K型不育系732A及其保持系732B,YS温敏雄性不育小麦A3017为材料,提取不同温度处理下各时期小穗的总RNA进行反转录,对AY914051和AY660990两个目标基因进行半定量PCR和电泳分析,测定其在小麦中的表达变化趋势,以分析其与这几种不育系的育性相关关系,探讨这几种不育小麦败育的关键发育时期。结果表明,除AY914051基因在2种保持系3314B和732B中表达量变化不大之外,其它均有明显差异;2个目标基因与这几种雄性不育系的败育有关,但与育性相关程度不同,不育系两个目的基因的表达受温度变化影响程度明显大于保持系。由实验结果推测,1B/1R类K型不育系、非1B/1R类K型不育系和YS温敏雄性不育系的败育关键时期为单核期或单核期至二核期之间;温度差异可能会导致YS温敏雄性不育系的育性相关基因表达时期错位,错位后的表达差异积累可能最终导致其败育。     

小麦光温敏雄性不育系BS366铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达分析

超氧化物歧化酶(SOD,superoxide dismutase)是植物中一种主要的抗氧化酶,在植物应对逆境胁迫及抗衰老中起重要作用。本研究从基因芯片数据中筛选获得小麦Cu/Zn-SOD基因的EST序列,通过序列比对后拼接得到小麦Cu/Zn-SOD的候选基因,利用PCR技术在小麦光温敏雄性不育材料BS366中克隆并获得该基因。通过对Cu/Zn-SOD基因序列进行生物信息学分析,结果表明,该基因拥有连续且完整的开放阅读框,长495bp,编码164个氨基酸。氨基酸序列分析发现,该蛋白具有保守的Cu/Zn-SOD功能结构域与典型的Cu/Zn-SOD三维结构,且定位于细胞质中。通过同源进化分析表明,该蛋白与二穗短柄草(Brachypodium distachyon(L.)Beauv.)和大麦(Hordeum vulgare L.)的Cu/Zn-SOD蛋白亲缘关系较近,相似度分别为89%和94%。利用实时荧光定量PCR技术对其在小麦不同组织的表达特异性及不同逆境胁迫下的表达模式进行分析,结果表明,该基因在根、茎、叶、雌蕊、雄蕊、颖壳中均有表达,属于组成型表达,且在小麦的地上部含叶绿体的组织中含量较高;同时受多种胁迫诱导,可能参与了多种胁迫诱导调控途径。通过对该基因在不同育性环境中BS366育性转换期花药中的表达模式分析,发现可育环境下,在小孢子母细胞时期和减数分裂期的表达量分别约为对照的8倍与16倍;而不育环境下,该基因表达水平无明显变化。因而推测,小麦Cu/Zn-SOD基因可能参与了光温敏雄性不育系BS366的育性调控。本研究为深入研究Cu/Zn-SOD基因在小麦中的作用机理奠定了重要基础。     

小麦T型细胞质雄性不育系、保持系蛋白质双向电泳比较研究

以小麦T型细胞质雄性不育系为材料,利用双向电泳技术,对苗期、分蘖期、拔节期和孕穗期叶片和花粉母细胞减数分裂期、单核小孢子期、二—三核小孢子期蛋白质变化作了分析。在细胞质雄性不育系小麦拔节期、孕穗期叶片中,有一个33KD/PI6.3蛋白组分存在,保持系中没有发现这个蛋白组分。在花粉败育的关键时期二—三核小孢子期,小麦细胞质雄性不育系有53KD/PI5.5、50KD/PI5.7、48KD/PI5.6和20KD/PI7.5四种蛋白组分存在,而保持系中也没有存在。小麦细胞质雄性不育系叶片和小孢子发育过程中存在的这五种特异蛋白可能参与育性调控,与细胞质雄性不育特性的形成有关。     

杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育花粉粒差异蛋白质组学研究

采用固相pH梯度/SDS-PAGE双向凝胶电泳对经杀雄剂SQ-1处理和未处理的小麦(Triticum aestivum)成熟期花粉总蛋白质进行了分离, 银染显色, 获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱. 通过PDQuest 2DE图像软件的分析, 在等电点4～7之间可识别350个以上较为清晰的蛋白质点, 其中差异表达明显的蛋白质点数为21个. 将11个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行了肽质量指纹图谱分析, 采用Mascot软件在Swiss-prot数据库查询, 鉴定出了7个蛋白质, 它们分别是液泡转化酶、动力蛋白轻链TCTEX-1、锰超氧化物歧化酶、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、抗坏血酸过氧化物酶、凝集素蛋白激酶和一种未知功能的蛋白. 对已知蛋白的功能进行分析, 推测杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育可能与能量代谢失衡、淀粉合成受抑制、活性氧积累、细胞凋亡以及花器官发育调节基因作用失控等有关.     

顺乌头酸酶基因在杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育花药中的表达分析

采用RT-PCR技术,克隆了小麦胞质顺乌头酸酶基因(cACO)部分cDNA序列.该cDNA序列长1368bp,编码456个氨基酸,GenBank登录号为GU475062.半定量RT-PCR结果表明,在生理型不育和可育花药发育的单核早期至三核期,cACO基因的表达水平均表现为先升后降;在生理型不育花药发育的单核晚期cACO基因表达水平与同期可育花药相比显著升高,到二核期和三核期明显降低,ACO酶活性变化表现出相同趋势.这反映出在小麦生理型不育系中,cACO基因在花药败育关键期异常表达可能影响了花药发育过程中正常的能量供应和物质代谢,导致花粉发育能量不足和所需物质匮乏,从而导致了非遗传型花药败育现象.     

茄子雄性不育系花粉败育的细胞学观察

以种间杂交创建的茄子雄性不育系为试材,采用形态学和细胞学观察对其花药形态、败育发生时期和机理进行了研究。结果表明：根据花药形态茄子雄性不育系材料可被划分为退化型、瓣化型和中间型3种类型;前期Ⅰ是3类不育系雄性败育发生的关键时期,绒毡层结构与功能异常可能是导致3类材料雄性败育的共性原因,减数分裂异常为败育的中间过程。花药瓣化类型不育材料在败育时期上表现出多样性,多糖类营养物质转运受阻也可能是其发生雄性败育的原因之一。     

APAGE技术在小麦细胞质雄性不育系选育中的应用研究

利用大量小麦亲本材料和优良品种(系)与具有粘果、易变、偏凸和二角山羊草细胞质的小麦雄性不育系杂交,筛选出一系列保持系。利用APAGE(酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳)技术对其进行了醇溶蛋白电泳图谱分析,发现大部分保持系表现出1BL/lRS易位系的1RS醇溶蛋白标记位点GldlB3。利用细胞学镜鉴,发现含有GldlB3标记位点的保持系均只含有两个随体,而不含有GldlB3标记位点的保持系均含有4个随体,证明了GldlB3标记位点与两个随体数的一致性。粘、易、偏型不育系育性基本表现一致,而二角型不育系除了与前3种不育系具有相同的保持系以外,对某些小麦品种(系)还表现出育性特异性。同时还讨论了ANGE技术在快速筛选小麦细胞质雄性不育保持系中的作用,为非1BL/1RS不育系的选育提供了必要的手段。     

小麦Ven型胞质雄性不育植株与可育植株花药蛋白质组差异研究

普通小麦具有偏凸山羊草（Ae. ventricosa）细胞质的不育系为Ven型胞质雄性不育系（Ven cytoplasmic male sterility, Ven CMS）,是粘类小麦CMS的一种类型。该研究对小麦Ven型雄性不育系冀5418A及其同型保持系冀5419B的单核期和二核期的花药进行差异蛋白质组学分析,探讨小麦质核互作雄性不育的分子机制。通过双向电泳分离花药蛋白,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱（MALDI TOF TOF）对差异表达蛋白进行质谱鉴定,利用生物信息学进行差异表达蛋白鉴定和功能注释分析。结果表明,在分子量19.0～100.0 kD、等电点4～7线性范围内,共检测到约2 000个蛋白点。2个时期共检测到差异蛋白98个,其中两个时期差异表达变化一致的蛋白点56个;数据库搜索获得鉴定的蛋白点41个,其中18个蛋白的表达量在冀5418A 中显著下调,23个在冀5418B 中明显下调。在不育系和可育系中均有参与能量代谢、活性氧代谢、核糖体合成、花粉物质合成的差异蛋白。GO分析预测差异蛋白生物学过程多涉及电子传递和能量代谢、核糖体代谢、活性氧代谢等,细胞组成主要是在膜区域和线粒体,分子功能主要是DNA和RNA结合功能和水解酶等。KEGG分析表明,较多蛋白分布于碳水化合物代谢、活性氧代谢和蛋白组装和折叠途径。推测不育系冀5418A 的雄性不育性除了涉及能量代谢、活性氧清除过程,核糖体蛋白、伴侣蛋白等也有重要作用,雄性不育性可能还与蛋白质加工、物质合成过程的紊乱有关。     

二角型非1B/1R 小麦CMS不育恢复体系的建立

通过对具有二角山羊草细胞质的1B/1R型小麦雄性不育系m s(A e.bicorn is)-5-1回交置换,获得了新型二角山羊草细胞质小麦雄性不育系m s(A e.bicor)-V 9125和m s(A e.bicor)-M 853.利用染色体制片、分子标记、原位杂交和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳对其保持系V 9125和M 853进行分子细胞遗传学检测,并对其育性恢复性机理进行了初步研究.结果表明:(1)V 9125和M 853均为非1B/1R易位系.V 9125为小麦-簇毛麦易位系,m s(A e.bicor)-V 9125是二角山羊草细胞质与普通小麦核背景中簇毛麦外源染色体互作产生的一类新的核质互作不育系.(2)M 853为小麦-滨麦易位系,m s(A e.bicor)-M 853是二角山羊草细胞质与普通小麦核背景中滨麦外源染色体互作产生的一类新的核质互作不育系.(3)利用一些普通小麦品种(系)与这两个不育系杂交,m s(A e.bicor)-V 9125和m s(A e.bicor)-M 853仅与T 6-3杂交育性得到恢复,且恢复度较高,变异小,而与其它大部分普通小麦杂交F1表现雄性不育,且扬花期花药不外露.而m s(A e.bicor)-5-1与包括T 6-3在内的普通小麦品种(系)杂交F1育性得到不同程度的恢复.从而得出结论,二角山羊草细胞质与小麦细胞核的互作存在两个不同的不育-恢复系统.     

洋葱花粉发育过程中ATP酶的分布特征(简报)

在真核细胞中,除了线粒体和叶绿体ATPase的功能是合成ATP外,其余部位ATPase是水解ATP以获取生物能量的代谢酶,在生物体细胞内广泛存在。探索ATPase在细胞中的分布状态是研究细胞生理状态的一种重要手段。ATPase在细胞中的多少可反映出细胞当时的生活状态,这一特征已被初步用于探索小麦和水稻雄性不育的细胞生物学研究中,希望通过比较可育花药和不育花药中ATPase的分布差异寻找雄性不育的机理,发现     

小麦中雄性不育同源序列的分离、鉴定及表达分析

利用拟南芥中已克隆的雄性核不育基因MS2和水稻中假定雄性不育蛋白的保守区域,设计一对简并引物,并在太谷核不育小麦可育株及不育株花药中进行扩增,得到了一条134bp的片段。以该片段为基础,通过电子延伸得到一个长为1604bp的序列,该序列编码的氨基酸包含一段由200个氨基酸组成的雄性不育保守区。RT-PCR结果表明,该雄性不育同源序列只在小麦可育花药中表达,而在小麦败育花药、叶片和根中不表达,说明该雄性不育同源序列为花药发育特异基因。     

小麦T型细胞质雄性不育系、保持系蛋白质双向电泳比较研究

以小麦T型细胞质雄性不育系为材料,利用双向电泳技术,对苗期、分蘖期、拔节期和孕穗期叶片和花粉母细胞减数分裂期、单核小孢子期、二—三核小孢子期蛋白质变化作了分析。在细胞质雄性不育系小麦拔节期、孕穗期叶片中,有一个33KD／P16．3蛋白组分存在,保持系中没有发现这个蛋白组分。在花粉败育的关键时期二—三核小孢子期,小麦细胞质雄性不育系有53KD／P15．5、50KD／P15．7、48KD／P15．6和20KD／P17．5四种蛋白组分存在,而保持系中也没有存在。小麦细胞质雄性不育系叶片和小孢子发育过程中存在的这五种特异蛋白可能参与育性调控,与细胞质雄性不育特性的形成有关。     

YS型小麦温敏雄性不育系A3017育性相关基因的SSH分析

以人工气候箱控温条件下YS型小麦温敏不育系A3017的不育幼穗和可育幼穗为材料,分别构建了不育和可育条件下基因特异表达的抑制消减杂交cDNA文库.在两个库中分别随机挑选100个阳性克隆进行测序,经BLAST序列比对分析,共获功能已知的EST 78条.比较发现,不育条件下与细胞质相关的基因表达数量(63.4%)远高于可育条件下的基因数量(35.1%),参与蛋白质合成、蛋白质修饰/加工/储藏、转运和信号传递过程基因的比例也均高于可育条件下的,而参与能量代谢过程基因的比例则明显偏低.分析认为,在不育和可育条件下的基因表达差异可能是导致温敏雄性不育系育性变化的关键,这为进一步从分子基础上揭示YS型小麦温敏雄性不育系育性转换机制奠定了基础.     

粘类非1BL／1RS小麦雄性不育系恢复性遗传规律的研究

系统考察了粘、易、偏和二角型4种异质非1BL／1RS小麦雄性不育系的育性恢复性,结果表明：(1)供试4种异质非1BL／1RS小麦雄性不育系均属易恢复、易保持不育类型;(2)以4种异质非1BL／1RS不育系为母本与同一父本或不同父本测交,其F1平均结实率与单株间结实率的变异系数呈显著负相关;(3)4种异质非1BL／1RS小麦雄性不育系,各自不育细胞质源对杂种F1的平均结实率影响程度不同,但不育胞质问恢复度差异不显著;(4)4种异质非1BL/1RS小麦雄性不育系,虽然育性载体相同,但粘、易型的育性位点、偏型育性位点和二角型育性位点各自在同一连锁群中的位置可能不同;(5)4种异质非1BL／1RS不育系和恢复系基因除主效育性基因外,亦在不同核型中存在有不等量的育性微效基因和抑制基因,其组成形式和杂交后的结合方式是粘类不育系育性恢复度高低的主要判别。