厚壳贻贝粘附蛋白十肽重复序列的表达及应用

 利用PCR扩增 Mcfp-1（M. coruscus foot protein-1）基因的12个十肽重复序列粘附功能片段（Mcfp~1 1~12）并连接到pGEX-4T1表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化的多肽产物经凝血酶处理切除GST标签,获得Mcfp-1 1~12功能肽段,最后用酪氨酸酶对该产物进行修饰.通过材料表面包被、石英晶体微天平（QCM, quartz crystal microbalance）分析、细胞粘附和细胞毒性等实验,研究了该表达产物作为生物粘合剂的粘附特性.结果显示,重组表达产物Mcfp-1 1~12在多种材料表面的包被能力与Cell-TakTM（天然提取的贻贝粘附蛋白混合物）相当,甚至更佳;对细胞的粘附能力与Cell-TakTM相当;用HeLa细胞和293T细胞进行的MTT实验未发现细胞毒性.上述结果表明,Mcfp-1 1~12作为生物医用粘合剂具有潜在应用价值;同时,基因重组技术可以为制备新型海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂提供有效的手段.本研究为临床使用更优质的生物医用粘合剂提供了理论依据.     

厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3的重组表达及黏附功能分析

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3（mussel foot protein-3, mfp-3）是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3的cDNA序列为目的基因,用PCR法扩增Mfp-3基因,并成功构建含有多聚组氨酸标签的重组mfp-3原核表达载体pET-21a/ Mfp-3.经IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside）诱导表达出重组蛋白,利用亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化,获得分子量为9.18 kD的重组蛋白.经酪氨酸酶催化、玻璃包被和石英晶体微天平（quartz crystal microbalance,QCM）分析.结果表明,重组厚壳贻贝mfp-3蛋白经酪氨酸酶催化后,L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴,L-3,4- dihydroxyphenylalanine, DOPA) 含量较高并且具有较好的黏附性能.上述研究为开发以mfp-3黏附蛋白为来源的生物粘合剂奠定了良好的基础.     

重组牛痘病毒介导的微小基因表达产物OVA257—264在真核细胞中的抗原呈递效率

应用含重组OVA微小基因及全长基因的牛痘病毒感染能够稳定表达Kb 分子的多种真核细胞 ,通过构象特异的单克隆抗体 2 5 .D 1.16 (anti OVA2 57～ 2 64/Kb)检测细胞表面复合物的形成情况 ,并借助四聚体技术检测了它们对抗原特异性T细胞的诱导能力。结果表明四聚体的构建是成功的 ,进一步用已被重组牛痘病毒感染的L92 9 Kb 细胞作为抗原呈递细胞以诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的产生 ,并对活化后特异性CTL进行检测 ,从胞外IFN γ的分泌情况看 ,诱导后的整个群体细胞发生了活化与增殖 ,H 2Kb OVA四聚体对特异性T细胞进行的结合分析与经典的细胞毒效应相一致。可见 ,重组牛痘病毒介导的微小基因产物OVA2 57～ 2 64不仅能为MHC I类分子的合成提供更有效的肽来源 ,且能更有效诱导特异性CTL的产生。     

中国林蛙细胞毒性核糖核酸酶的原核表达

目的:利用大肠杆菌以非包涵体的形式表达中国两栖动物林蛙的细胞毒性核糖核酸酶,探索原核表达系统表达细胞毒性核糖核酸酶的条件.方法:利用中国林蛙核糖核酸酶基因及表达质粒pFlag-CTS构建重组表达质粒,转导BL21后用IPTG诱导表达,观察不同诱导温度下细菌的生长情况.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹方法进行重组蛋白的检测.结果:通过观察不同诱导温度下细菌的生长情况,发现利用较低温度可以降低宿主细胞对表达产物细胞毒性的敏感性,成功地得到了这种目的基因的表达产物.结论:低温(20℃)可以有效表达目的蛋白.     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB、STⅠ肠毒素基因融合表达产物的免疫应答

合成O型口蹄疫病毒VP1蛋白中与细胞免疫(21～40表位肽)及体液免疫(141～160表位肽)相关的基因序列2020VP1,运用基因工程技术构建了含有肠毒素大肠杆菌LTB、STⅠ基因及双拷贝2020VP1的融合表达载体r2020-B-2020-STⅠ,转化宿主菌 BL21(DE3) RIL后的表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示重组融合蛋白的分子量约为45 kDa,表达量较高.ELISA实验结果显示,融合蛋白能与霍乱毒素(cholera toxin)CTB抗体特异结合.动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应;同时,融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击,免疫兔体能够产生STⅠ中和抗体,且融合蛋白不具STⅠ毒性,证明融合蛋白具有良好的LTB、STⅠ免疫原性.实验结果表明,此融合蛋白具有开发成为口蹄疫及肠毒素腹泻联合疫苗的应用价值.     

非复制重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒Bostwana C亚型Nef蛋白及免疫效果的观察

从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Bostwana C亚型全基因的质粒pJM4-HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southern blot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Western blot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中.NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep-IFN-'γ-Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN-'γ的C 8 T细胞(占脾细胞总数0.20%);经乳酸脱氮酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞.这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础.     

新型促细胞粘附重组人源性胶原的原核表达及功能性研究

选择一段与COL1A1基因相应序列同源、适合于在大肠杆菌E.coli中表达、含有编码促细胞粘附位点GER三肽密码子的基因序列。利用RT-PCR技术自人组织扩增该序列,构建pET28a(+)-COL重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。IPTG诱导表达获得重组人源性胶原RHDC, 表达量达到菌体总蛋白的40%左右。SDS-PAGE和Western Blot结果推测该胶原具有三螺旋结构。细胞粘附试验证明RHDC具有促细胞粘附能力,具有应用在生物材料领域的潜力。     

粉尘螨1类变应原T细胞表位重组蛋白的构建及鉴定

目的构建Der f1的T细胞表位融合肽基因的原核表达载体并表达鉴定。方法利用基因工程方法构建Der f1的T细胞表位融合肽嵌合基因,命名为Der f1T,并插入到原核表达载体p ET28a(+)中,形成重组原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T,进行双酶切和测序验证后的阳性克隆转化到E.coli BL21(DE3)诱导其表达。制样进行SDS-PAGE分析表达产物,再进行纯化,并Western bloting鉴定表达的蛋白。ELISA法测定重组蛋白对粉尘螨过敏的患者血清Ig E抗体的结合能力。结果双酶切和测序结果说明原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T构建成功;SDS-PAGE说明Der f1T诱导且纯化成功;Western bloting进一步说明Der f1T蛋白纯化成功;ELISA试验结果说明Der f1T对粉尘螨过敏的患者血清中Ig E结合能力与Der f1相比明显下降(P0.05)。结论成功表达Der f1的T细胞表位重组蛋白,为后续粉尘螨过敏患者提供特异性免疫治疗奠定基础。     

利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备重组人甲状旁腺素（1—34）肽

采用全基因分段合成和补丁连接相结合的方法构建了人甲状旁腺素 (hPTH) (1～ 34)肽基因 ,并利用GST融合表达系统 ,在大肠杆菌中克隆和可溶性表达了hPTH(1～ 34)肽基因。融合蛋白表达量占菌体总蛋白质的 2 5 %以上 ,经高密度发酵、亲和纯化后 ,在每升发酵液中得到了 10 g融合蛋白。融合蛋白经肠激酶一步加工并亲合纯化和反相脱盐后 ,最终可以得到约 0 .6g /L人甲状旁腺素 (1～ 34)肽纯品 ,样品的理论回收值达到了4 8.75 %。产物的纯度和性质经HPLC、毛细管电泳、质谱分析、N端测序等得到证明 ,并与化学合成产物的结果相吻合。兔肾皮质细胞测活表明 ,重组产物与化学合成人甲状旁腺素 (1～ 34)肽具有相近的腺苷酸环化酶激活活性。     

基于聚苹果酸的贻贝仿生粘合剂的制备及性能研究

目的:以实验室制得的聚苹果酸(PMLA)为高分子骨架,通过酰胺化反应将多巴胺(DA)分子连接到聚苹果酸,制得既具有良好粘合性能,又有优异生物相容性的贻贝仿生粘合剂。方法:L-天冬氨酸通过内酯开环聚合法合成高分子化合物聚苹果酸,将PMLA与DA加EDC/NHS反应得到粘合剂PMLA-DA,傅里叶变换红外光谱、核磁氢谱、紫外可见光光谱等对其进行结构表征,标准曲线法测多巴胺取代度,采用搭接剪切测试法评估粘合剂对不锈钢、玻璃、猪皮三种材质的粘合强度,MTT法检测贻贝仿生粘合剂的细胞毒性,通过降解试验验证PMLA-DA的降解性能。结果:测得PMLA-DA中多巴胺的取代度能达到21.3%,搭接剪切试验测得粘合剂对猪皮的粘合强度为22.68 kPa,高于目前市场上常用的生物医用粘合剂纤维蛋白胶15.38 kPa的粘合强度,PMLA-DA对不锈钢与玻璃亦有很好的粘合性能。细胞毒性研究和体外降解试验显示PMLA-DA无细胞毒性,降解性能良好。结论:通过聚苹果酸与多巴胺反应制得贻贝仿生粘合剂PMLA-DA,该粘合剂对多种材质均具有良好的粘合力;无细胞毒性,降解性能良好,对皮肤组织的粘合强度优于目前商用的生物粘合剂纤维蛋白胶。无论是对无机材料间的粘接,或者是医学领域的伤口粘合,均具有良好的应用前景。     

重组贻贝黏蛋白Mgfp-5的表达及功能评价

贻贝(Mytilus)中富含各种黏附蛋白,其中贻贝足丝蛋白5(Mytilus galloprovincialis foot protein type 5,Mgfp-5)是贻贝与外界基质进行黏附的主要蛋白分子之一。贻贝黏蛋白天然提取时产量低、易凝固且纯化困难,通过化学合成和基因工程等方法重组贻贝黏蛋白解决该问题。本研究在E.coli BL21(DE3)中表达了贻贝蛋白Mgfp-5,亲和层析纯化到Mgfp-5蛋白的含量为12.25%,纯度为96.92%;酪氨酸酶修饰Mgfp-5后,其DOPA(多巴,3,4-二羟基苯丙氨酸)含量为9.60 pmol/g,是修饰前的9.32倍,生物黏性增强到1 116 n N,是Cell-Tak TM黏性的1.60倍;3.0μg/cm2的Mgfp-5蛋白的毒性级别为1级;Mgfp-5浓度≤20μg/m L时对红细胞无溶血现象,具有生物安全性。本研究可为重组Mgfp-5蛋白研究奠定基础,同时为来源于Mgfp-5黏蛋白的临床生物黏合剂的研制提供参考。     

厚壳贻贝足丝盘黏附蛋白mcofp-3的重组真核表达

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)黏附蛋白分子mcofp-3(M.coruscusfoot protein-3)主要分布于贻贝足丝盘,贻贝在水环境下的黏附过程中起到关键作用,但因其难溶于水且在贻贝足丝盘中含量极低,故妨碍了对其进行深入研究。为建立厚壳贻贝足丝蛋白mcofp-3的真核表达体系,并获得足够的mcofp-3黏附蛋白进行后续研究,采用酵母表达体系对mcofp-3进行了重组表达。通过PCR方法克隆厚壳贻贝的mcofp-3基因,构建mcofp-3的酵母真核表达载体pVT102U/α/mcofp-3,鉴定结果表明,重组表达质粒pVT102U/α/mcofp-3由真核载体pVT102U/α和mcofp-3的成熟肽DNA片段组成,插入的mcofp-3成熟肽DNA片段与预期序列完全一致;采用LiAC转化法将重组表达质粒转化到S78酿酒酵母中,经过RT-PCR分析以及1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,重组的mcofp-3得到了成功的转录;发酵菌液经阳离子交换柱及高效液相色谱分离,以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测,结果表明,重组的厚壳贻贝黏附蛋白分子mcofp-3得到了成功表达,表达...     

以杆状病毒为载体表达可溶性55kD人肿瘤坏死因子受体

从培养的HeLa细胞中提取总RNA,通过反转录PCR技术, 从该总RNA中扩增了约530 bp的shTNFR55基因的cDNA,将cDNA克隆至转移载体pAcGp67B的多角 体蛋白基因启动子的下游与转移载体构建成重组转移质粒pAcTNFR。pAcTNFR与杆状病毒AcNP V的DNA共转染昆虫细胞sf9,通过同源重组形成含有shTNFR55基因的重组病毒。经空斑分析 和DNA斑点杂交获得了纯化的重组病毒AcNPVTNFR。采用肿瘤坏死因子(TNF)敏感的L929细 胞检测表达产物的生物学活性。结果表明表达产物可以中和TNF对L929的细胞毒性。蛋白配 基印迹(Ligand blot)分析表明表达产物分子量约在20～25kD之间,有三条带。     

人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达

采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白（osteogenic protein-1,OP-1）成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞,经鉴定的阳性重组质粒并线形化,电转化毕氏酵母细胞GS115,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,表达产物存在于培养基中,占分泌蛋白的10％.重组表达产物进行Western Blot可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性.     

金特异性结合短肽介导的重组杆状病毒与胶体金构成的纳米复合体

纳米金在生物探针方面的应用技术是重要的研究方向, 这一技术的关键在于纳米金与生物分子有效的结合, 本文通过基因重组策略, 研究杆状病毒表面展示技术与金特异结合肽介导的固定化方法联用以构建生物-无机复合材料的可行性。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将合成的金特异结合肽基因融合到杆状病毒BmNPV囊膜糖蛋白gp64的N端信号肽与成熟蛋白之间构成转移质粒载体, 经过转座得到重组穿梭质粒pFB-gp64-Au, 转染Sf9昆虫细胞后收获多角体启动子控制下表达融合蛋白的重组AcMNPV。同时采用硼氢化钠还原法制备得到胶体金, 进行组建病毒 胶体金复合结构的初步研究。结果表明, 成功构建的重组穿梭质粒转染细胞后得到囊膜表面经金无机结合肽修饰的AcMNPV重组病毒, 并通过透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察到由金特异结合肽所介导的病毒 胶体金的复合结构。这项研究有助于进行生物-无机复合体系构建及纳米材料在生物学领域应用的研究。     

人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应

目的:在原核表达系统中表达人乳头瘤病毒11型(HPV11)L2NE7E6融合蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠,检测其诱发的T细胞免疫水平,并筛选HPV11 E6、E7特异的T细胞表位肽。方法:用重叠PCR方法构建HPV11L2NE7E6融合基因并插入原核表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达融合蛋白L2NE7E6,用SDS-PAGE和West-ern印迹鉴定融合蛋白的表达。Q柱纯化蛋白后免疫C57BL/6小鼠,分别用覆盖HPV11 E6和E7蛋白序列的肽库,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其诱发的E7、E6特异的T细胞免疫反应,并筛选E7、E6特异的T细胞表位肽。结果:在原核表达系统中有效表达了HPV11 L2NE7E6融合蛋白,蛋白纯化后免疫C57BL/6小鼠,分别能检测到针对HPV11 E6、E7肽库刺激产生的特异性T细胞免疫反应。经肽池筛选到1条强的E6 T细胞表位肽E6aa41-55(AEI-YAYAYKNLKVVW);而E7只筛选到2条弱的T细胞表位肽,分别为E7aa53-67(QILTCCCGCDSNVRL)和E7aa73-87(DGDIRQLQDLLLGTL)。结论:HPV11 L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生E6、E7特异性细胞免疫反应,可作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

人促甲状腺素受体膜外区蛋白在原核系统表达及其生物活性鉴定

为研究重组人促甲状腺素受体 (hTSHR)膜外区表达产物及其生物活性与免疫活性 ,将hT SHR膜外区编码基因 (编码第 3～ 4 2 0位氨基酸 )重组到表达型质粒pGEX 4T 3上 ,测序结果表明序列正确 ,未改变读码框架 .然后转入E .coliAd4 94进行诱导表达 .纯化后的表达产物经SDS PAGE、Western印迹及放射受体法分别检测其分子量、免疫活性和生物活性 .重组TSHR3～ 4 2 0 膜外区蛋白 (简称TSHR3～ 4 2 0 )产率为 15 9～ 2 0 2 μg L培养基 ,分子量为 4 8.9kD ;融合蛋白 (简称GST TSHR3～ 4 2 0 )分子量为 75 .4kD .两种表达产物都可与TSHRAb反应 ;TSHR3～ 4 2 0 可与12 5I TSH结合 .     

转mgfp-5基因烟草的愈伤诱导及培养

海洋软体动物贻贝(Mytilidae)足丝腺分泌的贻贝粘蛋白(mussel adhesive protein,MAP)即贻贝足丝蛋白(mussel foot protein,Mfp),不仅有水中高粘性及耐腐蚀性,而且无毒、无免疫原性,生物相容性好,其中Mfp-5粘性最强。现用的贻贝粘蛋白主要是天然获取,但是其含量低易固化难获得,基因工程重组贻贝粘蛋白的研究刚刚开始。前期我们在烟草中表达了地中海贻贝蛋白(mytilus galloprovincialis foot protein type 5,Mgfp-5)基因,得到转mgfp-5基因烟草种子。本实验将转基因T1代种子无菌苗进行愈伤组织诱导,在附加不同浓度的2,4-D、6-BA、NAA的MS培养基上,诱导率≥90.0%,其中2,4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L时诱导率为100%;愈伤组织固/液培养过程中均以"S"型曲线生长,固体培养时12~27 d鲜质量增长率为3.73%,液体培养时间缩短6 d,在6~15 d时间内鲜质量会增加8.56~8.63倍;固/液培养的继代愈伤组织,PCR、RT-PCR及Western blotting分别检测到预期大小的电泳条带,显示了外源mgfp-5基因及Mgfp-5蛋白稳定表达。稳定表达Mgfp-5蛋白的愈伤组织,可以为获得重组蛋白Mgfp-5的原材料提供新途径,为研究植物表达贻贝粘蛋白提供参考。     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.