重组荞麦胰蛋白酶抑制剂通过下调己糖激酶Ⅱ抑制HepG2细胞生长

糖酵解过度活跃是肿瘤细胞能量代谢的显著特征。抑制过度糖酵解已经成为一种新的癌症疗法。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (recombinant buckwheat trypsin inhibitor, rBTI)可以通过上调磷酸酶及张力蛋白同源基因 (PTEN) 进而抑制HepG2细胞增殖。有关rBTI对肿瘤细胞能量代谢的影响仍未见报道。本研究中的MTT和ATP检测分析表明,rBTI以剂量依赖性方式抑制细胞活力及胞内ATP含量。qRT-PCR和Western印迹分析表明,rBTI处理HepG2细胞后,己糖激酶Ⅱ转录显著下调,但是糖酵解过程中的其他酶及葡萄糖转运蛋白基因在转录水平未发生显著变化,同时己糖激酶Ⅱ蛋白水平的表达也显著下调。酶活性分析也表明,rBTI能显著降低己糖激酶的活性。进一步分析表明, rBTI使细胞内PTEN转录及表达水平明显上调,己糖激酶Ⅱ转录和p-AKT,p-mTOR、己糖激酶Ⅱ的表达下调。当PTEN抑制剂phen存在时,可阻断rBTI诱导的己糖激酶 Ⅱ表达下降,表明rBTI能通过上调PTEN进而影响己糖激酶Ⅱ的表达。免疫荧光及Western印迹分析显示,rBTI作用后减弱了己糖激酶 Ⅱ在线粒体的定位,导致己糖激酶Ⅱ与线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白 (voltage-dependent anion channel, VDAC) 分离,促使己糖激酶Ⅱ从线粒体转位到细胞质,降低糖酵解的效率。上述结果证明,rBTI对肿瘤细胞能量代谢的调控作用主要通过抑制PI3K/AKT信号通路,下调己糖激酶Ⅱ的表达并影响空间定位,进而抑制肿瘤细胞糖酵解过程,导致癌细胞生长受到抑制。     

过表达CDX1蛋白对直肠癌细胞增殖及能量代谢的影响及机制研究

目的:探讨过表达尾侧同源盒转录因子1(CDX1)蛋白对直肠癌细胞增殖及能量代谢的影响。方法:以直肠癌细胞SW117为研究对象,细胞转染pIRES(空载体组)、pIRES-CDX1(过表达组),同时设置对照组(只加入转染试剂)。培养48 h后,Western blot检测细胞中CDX1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中三磷酸腺苷(ATP)含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量。结果:空载体组细胞中CDX1、Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达水平及细胞存活率、凋亡率、ATP含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量与对照组相比均没有明显差异。过表达组细胞存活率、p-Akt水平、ATP含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量与对组相比均明显下降,凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3表达水平均明显高于对照组。结论:过表达CDX1蛋白能够促进直肠癌细胞凋亡,抑制直肠癌细胞增殖,影响直肠癌细胞能量代谢,作用机制可能与p-Akt水平有关。     

大黄素抑制胃癌细胞糖酵解并促进凋亡

目的:探讨大黄素对人胃癌BGC-823细胞凋亡及糖酵解的影响。方法:采用不同浓度大黄素(30μmol/L、90μmol/L、180μmol/L)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)抑制剂处理人胃癌BGC-823细胞,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活力,采用试剂盒检测细胞葡萄糖消耗及乳酸水平,western blotting检测细胞己糖激酶Ⅱ、Bcl-2相关蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、PI3K、人低氧诱导因子1α(Human Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-α)的表达。结果:大黄素能浓度依赖性的抑制BGC-823细胞增殖、葡萄糖消耗,降低乳酸水平;并降低己糖激酶Ⅱ的表达,促进凋亡蛋白Bax表达。PI3K抑制剂可抑制胃癌细胞糖酵解水平,而将大黄素与PI3K抑制剂联合使用后,与单一抑制剂组比,对细胞糖酵解抑制水平进一步加强,大黄素可下调PI3K下游蛋白及HIF-α的表达。结论:大黄素对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用其作用机制与调节PI3K途径及HIF-α,并抑制己糖激酶Ⅱ表达降低胃癌细胞糖酵解水平相关。     

miR-598 对结直肠癌细胞转移潜能的影响

目的:探讨miR-598在结直肠癌转移中的作用和分子机制,为寻找新的结直肠癌治疗靶标提供理论依据。方法:收集30对人结直肠癌及癌旁正常组织标本,采用qRT-PCR检测miR-598的表达,采用Transwell和划痕实验确定miR-598对结直肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响,利用在线靶基因预测软件,筛选出miR-598可能的下游靶基因Jagged 1(JAG1),利用Western blot及双荧光素酶报告基因实验检测miR-598对JAG1及上皮间质转化标志物(Vimentin及E-cadherin)表达的影响。结果:与正常肠黏膜组织对比,miR-598在结直肠癌组织中的表达水平明显降低;miR-598显著抑制结直肠癌细胞的侵袭及迁移能力;分子机制分析证实miR-598能够作用于JAG1的3'-UTR并抑制其表达;过表达miR-598显著下调Vimentin的表达水平,而提高E-cadherin的表达水平。结论:miR-598在人结直肠癌中表达明显下调;miR-598通过靶向调控靶基因JAG1的表达,抑制结直肠癌细胞EMT,从而有效的抑制了结直肠癌细胞的侵袭和迁移。     

PKM2对乳腺癌细胞有氧糖酵解、增殖和凋亡的影响

[目的]探讨siRNA介导的PKM2基因沉默对乳腺癌细胞中有氧糖酵解、细胞增殖和凋亡产生的影响。[方法]荧光定量PCR检测乳腺癌细胞转染siRNA-PKM2的效率,葡萄糖和乳酸试剂盒及Western Blot检测细胞的糖酵解能力,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western Blot检测细胞的凋亡状况。[结果]与对照组相比,转染PKM2的siRNA 48h后,细胞摄取葡萄糖量及乳酸分泌量均明显降低(P0.05),两种与糖酵解相关的蛋白Glut1和PFK-1表达量均降低;细胞增殖速率减慢(P0.05);抗凋亡蛋白bcl-x L蛋白表达降低,促凋亡蛋白caspase-9蛋白表达增多。[结论]siRNA介导的PKM2基因沉默能抑制乳腺癌细胞的有氧糖酵解及增殖能力,并促进细胞凋亡。     

结直肠癌细胞CES2表达对CPT-11化疗敏感性的影响

目的:研究异常甲基化在调控结直肠癌细胞中CES2基因表达中的作用,并观察结直肠癌细胞内CES2表达与化疗敏感性的关系.方法:采用MSP检测八种结直肠癌细胞系中CES2基因启动子甲基化;荧光定量PCR和westemblot方法检测DAC去甲基化后CES2 mRNA及蛋白表达变化;采用MTT法,检测各型结肠癌细胞株对伊利替康的细胞毒性.计算IC50并分析其与CES2mRNA表达的相关性.结果:CES2基因启动子在八种结直肠细胞株中均呈未甲基化状态,使用DAC处理后,CES2在其低表达的细胞株无明显增加,不同结直肠癌细胞株对CPT-11敏感性存在差异(P<0.05),其中LoVo细胞对CPT-11敏感性最低.RKO细胞对CPT-11的敏感性最高.结直肠细胞株内CES2表达与It50呈负相关性(r=0.58651,P<0.01).结论:甲基化不参与调控CES2基因的表达,CES2表达与CPT-11细胞毒性呈正相关.     

荷叶碱抑制Akt/mTOR/4EBP1-糖酵解通路抗胆管癌细胞增殖作用研究

本研究基于网络药理学探究荷叶碱抑制人肝内胆管癌细胞HuCCT1增殖的分子机制。采用MTT比色法、克隆形成实验检测荷叶碱对HuCCT1细胞增殖的影响；采用比色法、分光光度法检测荷叶碱对糖酵解生化指标的影响；通过网络构建和富集分析预测荷叶碱作用于肝内胆管癌的潜在靶点及通路，以此为基础探究荷叶碱影响HuCCT1细胞增殖的可能机制。结果表明荷叶碱能抑制HuCCT1增殖，显著降低细胞葡萄糖消耗及乳酸生成，并呈时间和剂量依赖性；网络药理学分析显示荷叶碱主要通过PI3K/Akt、MAPK、HIF-1信号通路影响肝内胆管癌生长、运动；聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)结果显示(30、60、120μmol/L)荷叶碱能降低低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、己糖激酶2(HK2)和丙酮酸激酶2(PKM2)的mRNA水平和蛋白表达，同时下调p-Akt^Thr308、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表达。综上，荷叶碱可能通过影响Akt/mTOR/4EBP1信号级联调控的糖酵解活性抑制HuCCT1细胞增殖。     

mir-615-5p 通过靶向调节癌基因TRAF4抑制非小细胞肺癌细胞的增殖

已知mir-615-5p可抑制癌细胞的增殖,然而其具体分子机制尚不明确。本研究证明,mir-615-5p通过负调节癌基因TRAF4,从而抑制NSCLC细胞的增殖。运用实时定量PCR检测NSCLC患者癌组织和癌旁正常组织、正常人肺支气管上皮细胞系HBE和3种人源NSCLC细胞系中mir-615-5p的表达,发现与正常的组织和细胞相比,mir-615-5p在NSCLC癌组织和癌细胞中表达水平显著降低;运用Western印迹检测HBE细胞和NSCLC细胞系中TRAF4蛋白的表达,发现TRAF4在NSCLC细胞中表达显著升高;MTT和CCK 8分析结果显示,转染mir-615-5p mimic 可显著降低NSCLC细胞的增殖能力;生物学信息分析和萤光素酶报告基因检测结果显示,mir-615-5p可靶定结合TRAF4 mRNA,并下调TRAF4蛋白的水平;pcDNA-TRAF4转染后细胞增殖检测结果显示,过表达TRAF4能够消除mir-615-5p引起的细胞增殖抑制作用。综上所述,mir-615-5p通过靶定结合癌基因TRAF4的mRNA,下调TRAF4蛋白的水平,从而抑制NSCLC细胞的增殖。     

在肝癌细胞SK-Hep1中沉默STAT3基因增强sorafenib疗效的初步研究

目的:研究STAT3在肝癌细胞SK-Hep1对sorafenib抗性中的作用,并探讨STAT3基因沉默在增强sorafenib肝癌疗效中的作用。方法:应用基于shRNA的基因沉默技术在肝癌细胞SKHep1中敲减STAT3;用CCK8法检测细胞的生长情况与对sorafenib的敏感性;蛋白印迹法(Western blot)检测STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)以及其下游蛋白的表达变化。结果:成功构建了STAT3敲减的细胞株SK-Hep1-sh STAT3。该细胞中STAT3蛋白表达降低,细胞增殖明显受到抑制。Sorafenib的处理下调了STAT3的磷酸化水平及其下游蛋白Mcl-1和Cyclin D1的表达。STAT3基因敲减的SK-Hep1细胞,对sorafenib的敏感性增强。结论:基于shRNA的STAT3基因沉默能明显抑制SK-Hep1细胞增殖,提高细胞对sorafenib的敏感性,有望成为提高sorafenib抗肝癌疗效的一种新手段。     

CDK4基因沉默对非小细胞肺癌A549 增殖和代谢的影响

目的:通过特异性小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),使CDK4基因沉默,探讨该基因沉默对肺癌A549细胞增殖和代谢的影响及其可能的作用机制。方法:将靶向CDK4小干扰RNA(si RNA-CDK4)和阴性对照干扰片段(si RNA-control)成功转染A549细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分别检测CDK4在m RNA和蛋白水平的变化;细胞计数法、CCK-8法和软琼脂糖克隆形成实验检测A549增殖的变化和克隆形成能力;FCM法检测A549细胞的细胞周期;18F-FDG摄取实验、乳酸检测试剂盒及海马技术检测A549细胞中葡萄糖、乳酸的量及氧耗的变化;利用RT-PCR检测CDK4基因沉默后A549细胞中糖代谢相关酶m RNA水平的变化。结果:将靶向CDK4小干扰RNA(si RNA-CDK4)转染A549细胞后,可明显抑制CDK4的m RNA和蛋白表达(P0.001,P0.01)。CDK4蛋白抑制后,细胞增殖在48、72和96 h均明显降低(P值均0.05),G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显减少(P值均0.05);18F-FDG摄取量下降(42.21±1.90)%(P0.05),乳酸的生成量减少(29.39±5.35)%(P0.05),而细胞的基础耗氧量增加(67.17±3.58)%(P0.01);糖酵解相关酶PFKFB3、PKM2、LDHA在m RNA水平均明显减低(P0.001,P0.01,P0.001)。结论:抑制CDK4表达可明显降低糖酵解水平,并增加耗氧量;同时可引起细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞增殖。其机制可能与CDK4直接或间接调节糖酵解相关酶的表达有关。