法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段。首先用Primer5．0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMDl8-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33／pPICZα-A-VP2。工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55kDa,比预期的41kDa大。凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28％,表达量可达23mg／L。间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清。     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段在Pichia pastoris中的表达

伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白E是一种在伪狂犬病根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因去信号肽片段克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZαA中,获得的重组表达载体pPICZαA-FL电击转化野生型酵母菌SMD1168后,得到多株酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL.经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、工程菌的诱导表达及表达产物的鉴定,最后得到高效表达gE基因去信号肽片段的酵母工程菌SMD1168/pPICZαA-FL-7.工程菌72 h培养上清的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质印迹结果显示,gE基因去信号肽片段表达产物大小约为80 ku,比预期的63.8 ku大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的13.49%,表达量可达11.7 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分伪狂犬病病毒gE标准阳性与阴性血清.     

猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.     

猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2 的ORF2 基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X 33染色体上,构建了X 33(pPICZa ORF2)重组工程菌。经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段。经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L。间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清。     

虎源猫瘟热病毒VP2蛋白基因在毕赤酵母中的表达

克隆了虎源猫瘟热病毒VP 2蛋白基因并首次在Pichia pastoris酵母中进行了分泌表达。用特异性引物从虎源FPV中扩增出VP 2基因,将其克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pTVP 2进行测序。用EcoR I和NotI双酶切pTVP 2,回收目的基因VP 2片段将其定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZαAVP 2。将pPICZαAVP 2用SacI内切酶线性化后,电转化毕赤酵母细胞GS115,PCR法筛选阳性重组酵母,并用1%甲醇诱导表达。结果在重组酵母菌培养物上清中经SDS-PAGE检测到相对分子量约为32 kD的重组蛋白,W estern-b lotting证实该重组蛋白可以与FPV多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明重组VP 2蛋白具有正确的空间构象,有望作为虎FPV感染的诊断和免疫预防用抗原。     

重组毕赤酵母产青蛤Mytimacin抗菌肽的表达研究

Mytimacin是主要在无脊椎动物中表达的Macin抗菌肽家族中的一员,具有较强的抗病原微生物活性,是利用重组DNA技术开发天然抗菌剂的良好候选者。通过RT-PCR从青蛤(Cyclina sinensis)闭壳肌中克隆编码Mytimacin成熟肽的基因,经3次PCR在该基因的5’端添加Xho I限制性酶切位点和信号肽酶识别位点、3’端添加Xba I限制性酶切位点和6×His,获得目的基因"CsMm";以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33为工程菌,构建重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm。通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,在28℃、250 r/min条件下,使用1.5%的甲醇诱导表达72 h;使用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,并通过MALDI-TOF-TOF质谱分析对纯化产物进行鉴定。另外,通过涂布法和浊度法考察重组CsMm的抑菌活性。结果表明:基于X-33/pPICZαA-CsMm重组毕赤酵母的外源表达获得了表达量为25.6 mg/L的重组蛋白,经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定其为分子量约7.8 kD的预期重组CsMm。抑菌试验证明重组CsMm对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)具有明显的抑菌活性。构建的重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm能有效合成具有生物学活性的重组青蛤Mytimacin,旨为贝类来源天然小分子抗菌剂的开发提供可资参考的技术途径。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。