转基因玉米HGK60在不同遗传背景下抗虫性鉴定及农艺性状分析

为研究转基因玉米HGK60在不同遗传背景下遗传稳定性和抗虫效果,利用转Bt cry1Ah基因的转基因玉米HGK60为供体,通过回交转育的方式将cry1Ah基因分别导入玉米自交系郑58、昌7-2、lx05-4、lx03-2,获得转基因玉米自交系HGK60-郑58、HGK60-昌7-2、HGK60-lx03-2、HGK60-lx05-4,并杂交获得HGK60-郑单958（HGK60-郑58 × HGK60-昌7-2）和HGK60-鲁单9066（HGK60-lx05-4 × HGK60-lx03-2）,转化体特异性PCR证明cry1Ah基因已转入不同遗传背景玉米中,ELISA检测不同遗传背景转基因玉米叶片中Cry1Ah蛋白表达情况,结果表明在不同遗传背景玉米自交系和杂交种中Cry1Ah蛋白表达没有显著差异;田间人工接虫和室内玉米螟抗虫性鉴定结果表明,不同遗传背景的转基因玉米高抗玉米螟,室内接虫后4 d幼虫死亡率达到100%;对不同遗传背景转基因玉米HGK60进行农艺性状分析,结果显示与受体对照玉米相比,两者之间农艺性状没有显著差异,转基因玉米HGK60可用于抗虫玉米品种的选育。     

抗虫抗除草剂转基因玉米HiII-NGc-1的遗传稳定性分析

目的基因和目标性状遗传稳定性是转基因植物新品种选育和产业化的重要前提。以进入农业部环境释放的抗虫抗除草剂双价转基因玉米Hi II-NGc-1为试验材料,采用PCR、RT-PCR和免疫试纸条技术检测转基因玉米连续3代目的基因cry NGc和bar整合及表达的遗传稳定性,采用心叶期除草剂草铵膦抗性鉴定和心叶期/穗期亚洲玉米螟抗性鉴定实验详细分析了目标性状的遗传稳定性。研究结果表明:Cry NGc和PAT蛋白在Hi II-NGc-1中连续3代遗传稳定,高世代稳定耐受正常5倍大田除草剂草铵膦使用浓度,心叶期和穗期高抗亚洲玉米螟性状稳定,具有潜在的产业化应用价值。转基因玉米Hi II-NGc-1目的基因和目标性状遗传稳定性的明确为开展下一步生物安全评价奠定了基础,对复合性状转基因抗虫抗除草剂玉米新品种的选育和产业化具有重要意义。     

花粉介导法获得耐草甘膦玉米植株及其耐性研究

为获得耐草甘膦转基因玉米植株,进而研究其除草剂耐性及外源基因的遗传特性,以质粒p BI101-aroA-M12为外源基因供体,以玉米自交系昌‘7-2’为受体,采用花粉介导法将外源基因导入玉米自交系中。PCR扩增、Southern杂交分析的结果证明获得了54个转基因植株;对其后代株系的分子检测及田间生物学鉴定,结果证明目的基因可以稳定遗传给后代植株,且赋予和提高了转基因植株的除草剂耐性。目的基因在转化体中的遗传规律研究,结果显示导入的目的基因在F2受体植株中以3∶1的比例发生遗传分离,符合孟德尔单因子显性遗传分离规律。ELISA分析和蛋白质浓度测定的结果证实目的基因在转化植株中得到表达,表达量介于40.5-112.6 ng/g叶片鲜重之间,目的基因表达量与该植株的除草剂耐性性状间呈极显著相关,r=0.942 3(P0.01)。最终研究获得了4个高草甘膦耐性的转基因纯合株系。     

转EPSPS基因抗除草剂玉米CC-2对田间节肢动物多样性的影响

【背景】转基因手段已成为改良玉米品种的重要途径之一,具有诸多优点的转基因玉米越来越受到人们的青睐。转基因玉米带来巨大经济和社会效益的同时,其安全风险问题也引发人们广泛关注,因此有必要对转基因玉米进行生物多样性影响评价。【方法】采用直接观察法和陷阱法对种植转EPSPS基因抗除草剂玉米CC-2及其对应的非转基因对照郑58的田间节肢动物进行调查,分析其群落组成、群落结构及主要类群动态。【结果】转基因玉米CC-2无论是喷施除草剂还是不喷施除草剂处理,与其对应的非转基因对照郑58相比,田间节肢动物群落组成、群落结构,以及田间主要节肢动物类群动态均无显著差异。【结论与意义】初步认为转EPSPS基因抗除草剂玉米CC-2对节肢动物多样性无安全风险,为转EPSPS基因抗除草剂玉米的推广提供一定生态安全数据。     

抗除草剂bar基因与EPSPS基因在转基因甘蔗中的应用研究

通过农杆菌介导法,分别将bar基因和EPSPS基因导入到甘蔗中,分别获得了抗草铵膦和草甘膦两种除草剂的转基因甘蔗。通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦除草剂,证明了转基因甘蔗T0、T1代、宿根1代和宿根2代外源基因遗传稳定,且均具有稳定的耐除草剂的功能。因此转耐除草剂基因的甘蔗,可以与转耐除草剂基因的玉米、大豆、油菜和棉花一样,有广阔的应用前景。     

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米的分子检测及农艺性状分析

利用农杆菌介导法将具有自主知识产权的Bt cry1Ah基因转入玉米自交系综31中,在获得的1 764株转基因植株中筛选获得1株对玉米螟有显著抗性的转基因植株。对该抗性植株进行了室内和田间抗虫性分析及外源基因表达分析,并研究了其杂交后代的农艺性状。结果表明,该转基因植株对亚洲玉米螟田间抗虫性达到高抗水平;外源基因能够正常高效表达,在玉米抽穗期的叶片中Cry1Ah蛋白表达量最高,达到1μg/g鲜重;株高、穗位高、穗长、穗粗等与非转基因对照植株相比差异不大,秃尖长明显短于对照,千粒重及单株产量明显高于对照,这种差异在人工模拟虫害爆发情况下达到极显著水平。     

cryIAc基因在转基因玉米中的遗传规律及对抗虫性影响

旨在研究目的基因在转基因植株和后代植株(株系)中的遗传规律及其对转化植株抗虫性的影响。以花粉介导法将cryIAc基因导入玉米自交系‘郑58’和‘昌7-2’,对转化植株及其后代株系进行分子检测和田间抗虫鉴定。结果表明:(1)转化‘郑58’和‘昌7-2’,T1代分别获得转基因植株24和41个,转化率高达20%以上;(2)转基因T2代、杂交F2代及回交1代(B1)的分子检测结果证明,外源基因的遗传符合孟德尔的3∶1、3∶1和1∶1的遗传分离规律;(3)连续多带的分子检测结果还表明,外源基因可稳定遗传并有效表达,表达水平在9.8-14.3 ng/g叶片鲜重之间;(4)抗虫鉴定结果显示,在阴性对照全部感虫情形下,转基因纯合株系仍表现出较高抗虫活性;(5)此外,回交试验结果还证明外源基因通过杂交可传递给下一代;(6)最终经筛选得到SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007五个高抗虫转基因株系。结果表明,花粉介导法是一种高效、快捷的转化方法,cryIAc基因导入玉米自交系植株后赋予和提高了转基因植株的抗虫活性。     

草地贪夜蛾和其它五种重要鳞翅目害虫蛹的形态特征比较

【目的】田间草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)蛹与斜纹夜蛾Spodopteralitura Fabricius、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)、粘虫Mythimna separata(Walker)、棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5种重要鳞翅目害虫蛹容易混淆。明确草地贪夜蛾与其它5种重要的鳞翅目害虫蛹的形态差异,为田间鳞翅目害虫蛹的准确鉴别和田间调查提供依据。【方法】采用体式显微镜拍照观察并分析草地贪夜蛾蛹、斜纹夜蛾蛹、甜菜夜蛾蛹、粘虫蛹、棉铃虫蛹和亚洲玉米螟蛹的外部形态特征,根据相关特征差异编制了区分草地贪夜蛾与此5种鳞翅目害虫的检索表和快速区分表。【结果】草地贪夜蛾蛹主要特征为中足末端到达下颚末端之前,触角末端到达中足末端之前;中胸背板前缘略直;第4-7腹节背面前缘着生多行粗点刻;腹部末端臀棘上着生1对基部分开呈八字形的刺。草地贪夜蛾蛹腹部末端臀棘部位与其它5种害虫均不相同,辅以附肢位置、中胸背板前缘线和腹部点刻等特征可以准确将其与斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫和亚洲玉米螟的蛹区分。斜纹夜蛾中胸背板前缘线和臀棘上的刺与草地贪夜蛾有异;甜菜夜蛾下颚与中足位置及臀棘上的刺与草地贪夜蛾有异;粘虫腹部点刻和臀棘上的刺与草地贪夜蛾有异;棉铃虫触角末端位置和腹部末端的刺与草地贪夜蛾有异;亚洲玉米螟腹足遗迹和臀棘上的刺与草地贪夜蛾有异。【结论】根据蛹的结构特征,可以区分草地贪夜蛾与斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫和亚洲玉米螟等害虫的蛹。     

7种生物杀虫剂对草地贪夜蛾和粘虫幼虫的毒力与防效

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和粘虫Mythimna separata是我国玉米上的重要害虫,二者在田间混合发生,对玉米安全生产构成严重威胁.为筛选同时控制草地贪夜蛾与粘虫的高效生物杀虫剂,采用饲料药膜法和喷雾法分别测定了7种生物杀虫剂对草地贪夜蛾和粘虫2龄幼虫的室内毒力和田间防效.室内生测结果表...     

不同启动子驱动下马铃薯蛋白酶抑制剂PinⅡ转基因水稻的遗传、表达和对粘虫抗性分析

以不同启动子驱动的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因(PinⅡ-2x ,PinⅡ-4x)转基因水稻为材料,经潮霉素抗性、PCR和Southern blot等检测对转基因水稻后代进行了遗传分析。结果显示：外源基因在68.4%的转基因植株中符合孟德尔遗传模式,单拷贝植株率为63.6%。转基因植株后代的PinⅡ蛋白活性测定结果表明：ActI和Ubi驱动的PinⅡ-2x转基因水稻植株中,每克鲜叶片的PinⅡ蛋白含量为160μg和176μg,而由PIN5′驱动的PinⅡ-4x为104μg,对照水稻仅为20μg。ActI和Ubi驱动的PinⅡ表达产物对胰蛋白酶活性抑制程度分别达到37.7%和43.1%,明显高于PinⅡ自身启动子PIN5′（29.2%）。叶片饲养粘虫幼虫的实验表明：转基因植株叶片对粘虫有抗性,但抗性达不到显著水平,且启动子效率、PinⅡ表达量与抗粘虫      

转GAFP基因棉花生态适合度及其对棉田昆虫群落的影响

新型转基因棉花生态适合度及其对棉田昆虫群落的影响是转基因棉花环境安全评价的重点内容.本文选用新型转GAFP(Gastrodia anti-fungal protein)基因棉花及其非转基因亲本棉花为试验材料,于2013和2014年在河南安阳研究了田间棉花生态适合度及其对昆虫群落的影响.结果表明: 转基因棉蕾期、花铃期和铃期叶片干物质量与其亲本无显著差异;苗期比叶面积显著低于亲本,蕾期、花铃期和铃期叶面积显著大于亲本;苗期株高显著低于亲本,蕾期、花铃期和铃期株高与亲本无显著差异;棉花生长的4个关键时期(苗期、蕾期、花铃期和铃期),转基因棉单株果枝数、蕾数和脱落数均与亲本无显著差异,而铃期单株大铃数显著低于亲本.棉铃虫发生的3个高峰期,转基因棉对棉铃虫和甜菜夜蛾无明显控制作用,且对棉田昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的昆虫个体总数、昆虫群落结构与组成、均匀性指数、多样性指数和优势集中性指数均无显著影响.表明外源基因GAFP导入后,新型转基因棉花营养生长增强,产量构成性状整体无显著变化,未引起棉田昆虫群落变化.研究初步明确了新型转基因棉花生存竞争势态和棉田昆虫群落发生规律与动态,可为新型转基因棉花环境安全评价提供理论依据,同时为转基因棉花环境安全评价积累科学数据.     

转GAFP基因棉花生态适合度及其对棉田昆虫群落的影响

新型转基因棉花生态适合度及其对棉田昆虫群落的影响是转基因棉花环境安全评价的重点内容.本文选用新型转GAFP(Gastrodia anti-fungal protein)基因棉花及其非转基因亲本棉花为试验材料,于2013和2014年在河南安阳研究了田间棉花生态适合度及其对昆虫群落的影响.结果表明: 转基因棉蕾期、花铃期和铃期叶片干物质量与其亲本无显著差异;苗期比叶面积显著低于亲本,蕾期、花铃期和铃期叶面积显著大于亲本;苗期株高显著低于亲本,蕾期、花铃期和铃期株高与亲本无显著差异;棉花生长的4个关键时期(苗期、蕾期、花铃期和铃期),转基因棉单株果枝数、蕾数和脱落数均与亲本无显著差异,而铃期单株大铃数显著低于亲本.棉铃虫发生的3个高峰期,转基因棉对棉铃虫和甜菜夜蛾无明显控制作用,且对棉田昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的昆虫个体总数、昆虫群落结构与组成、均匀性指数、多样性指数和优势集中性指数均无显著影响.表明外源基因GAFP导入后,新型转基因棉花营养生长增强,产量构成性状整体无显著变化,未引起棉田昆虫群落变化.研究初步明确了新型转基因棉花生存竞争势态和棉田昆虫群落发生规律与动态,可为新型转基因棉花环境安全评价提供理论依据,同时为转基因棉花环境安全评价积累科学数据.     

棉田棉铃虫寄生峰对常规棉及转Bt棉品种的趋性反应

连续4年采用人工定期释放棉铃虫卵、幼虫和定期回收法,研究了不同棉花品种与棉铃虫卵期、幼虫期寄生蜂种群数量变化的关系.通过对卵、幼虫寄生率反正弦转换后进行方差分析表明,无论是在棉铃虫卵期还是在其幼虫期,转基因棉田中棉铃虫卵和幼虫的被寄生率始终显著低于其亲本对照棉.运用“Y”型嗅觉仪测定转基因棉及其亲本对照棉对棉铃虫幼虫寄生蜂———中红侧沟茧蜂的选择性行为反应,用成对数据进行方差分析,并进行了“T”测验.结果表明,转基因棉对棉铃虫寄生蜂有较强的忌避反应,且取食转基因棉的棉铃虫幼虫与被害转基因棉两者的共同组合与单独被害棉之间对寄生蜂的忌避效应基本一致.     

转基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花对棉铃虫的抗虫性及对二种地老虎幼虫生长发育的影响

为了明确转Bt Cry1A+CP4EPSPS基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)的抗性水平及对八字地老虎Amathes c-nigrum和黄地老虎Agrotis segetum的影响,作者用转基因棉花和非转基因棉花叶片对棉铃虫、八字地老虎和黄地老虎幼虫进行了室内饲养观察。结果表明,转基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花对新疆南部第2代棉铃虫表现为中抗,幼虫校正死亡率为70.4%;棉花叶片在整个生育期均能表达Bt毒蛋白,整个生育期Bt毒蛋白含量呈逐渐降低的趋势。转基因抗棉铃虫抗草甘膦棉花对八字地老虎幼虫有强烈的毒杀作用,可以引起幼虫大量死亡,对存活幼虫的生长发育也有明显的抑制作用,幼虫发育迟缓,不能顺利化蛹;但对黄地老虎幼虫没有明显的影响,幼虫可以正常生长。     

外源褪黑素调控棉花枯萎病抗性研究

为探究外源褪黑素对棉花抗枯萎病的影响及作用机理,以海岛棉新海14号为材料,于叶面喷施不同浓度褪黑素（0、10、25、50、75、100 μmol/L）后接种棉花枯萎病菌,对枯萎病菌侵染后棉花幼苗进行抗病性鉴定、抗病相关酶活性及基因表达分析。结果表明,外源褪黑素对棉花枯萎病菌的生长无抑制作用,10-100 μmol/L褪黑素均能在一定程度上提高棉花对枯萎病的抗性,其中50 μmol/L褪黑素处理效果最好。与对照相比,50 μmol/L褪黑素预处理能有效减少接菌后棉花叶片中的过氧化氢（H₂O₂）含量和超氧阴离子（O₂^·-）的产生速率,增强过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、几丁质酶（CHT）、β-1,3葡聚糖酶（GLU）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性,并显著提高木质素代谢途径相关基因（GbPAL、Gb4CL和GbCAD）和类黄酮代谢途径关键基因（GbCHI、GbDFR和GbTT7）的表达量。表明50 μmol/L 的褪黑素处理能提高接菌后棉花抗氧化能力,增强防御酶活性,调控木质素、类黄酮代谢途径相关基因的表达,从而提高棉花对枯萎病的抗性。     

Bt-Cry5Aa 基因转化棉花及其抗虫性鉴定

我国棉花抗虫基因大都为Cry1Ab/c,抗性风险日趋增加。本研究依据棉花密码子偏好,人工合成Bt-Cry5Aa抗虫基因,通过花粉管通道法转入棉花,并通过卡那霉素法及PCR方法对不同世代转化株进行鉴定,同时进行了抗虫性测试。结果表明,通过花粉管通道法成功获得转Bt-Cry5Aa基因植株,通过田间卡那霉素鉴定,阳性株率T1为7.76%,T2为73.1%,T3为95.5%;PCR检测显示,T1阳性率为2.35%,T2为55.8%,T3为94.5%;田间抗性试验分析,转Bt-Cry5Aa株系对第2、3、4代棉铃虫校正死亡率分别达到85.42%、75.35%和62.79%,其抗虫性与GK19相比差异不显著;Bt-Cry5Aa能够部分替代目前主流鳞翅目抗虫基因,是棉铃虫的新抗源。     

光信号转导因子HY5调控拟南芥分枝的功能研究

光是影响植物分枝的重要外在环境因素,但光信号因子HY5（ELONGATED HYPOCOTYL5）是否调控植物分枝目前尚不清楚。创制了HY5转基因超表达植株,并获得商业化T-DNA插入突变体纯合植株。通过比较野生型（WT）、超表达植株（HY5-OE）、突变体（hy5-215）的分枝数目发现,与野生型相比,超表达植株分枝数目显著增加,而突变体分枝数目则显著减少。进一步比较这些遗传材料的拟南芥植株分枝的负调控关键因子BRC1（BRANCHED1）转录本水平差异,发现与野生型相比,超表达植株中BRC1转录本显著下调、突变体中显著上调。研究结果表明,HY5通过抑制拟南芥分枝关键负调控因子BRC1的转录水平,进而促进拟南芥的分枝。研究结果为阐明HY5调控分枝的生物学功能提供了一定的理论依据。     

Increased frequency of pink bollworm resistance to Bt toxin Cry1Ac in China

Transgenic crops producing insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis (Bt) kill some key insect pests, but evolution of resistance by pests can reduce their efficacy. The main approach for delaying pest adaptation to Bt crops uses non-Bt host plants as "refuges" to increase survival of susceptible pests. To delay evolution of pest resistance to transgenic cotton producing Bt toxin Cry1Ac, the United States and some other countries have required refuges of non-Bt cotton, while farmers in China have relied on "natural" refuges of non-Bt host plants other than cotton. The "natural" refuge strategy focuses on cotton bollworm (Helicoverpa armigera), the primary target of Bt cotton in China that attacks many crops, but it does not apply to another major pest, pink bollworm (Pectinophora gossypiella), which feeds almost entirely on cotton in China. Here we report data showing field-evolved resistance to Cry1Ac by pink bollworm in the Yangtze River Valley of China. Laboratory bioassay data from 51 field-derived strains show that the susceptibility to Cry1Ac was significantly lower during 2008 to 2010 than 2005 to 2007. The percentage of field populations yielding one or more survivors at a diagnostic concentration of Cry1Ac increased from 0% in 2005-2007 to 56% in 2008-2010. However, the median survival at the diagnostic concentration was only 1.6% from 2008 to 2010 and failure of Bt cotton to control pink bollworm has not been reported in China. The early detection of resistance reported here may promote proactive countermeasures, such as a switch to transgenic cotton producing toxins distinct from Cry1A toxins, increased planting of non-Bt cotton, and integration of other management tactics together with Bt cotton.     

转基因抗虫抗除草剂棉花对棉铃虫抗性及对草甘膦耐受性研究

本论文研究了抗虫又抗除草剂棉花对草甘膦的耐受程度,比较了这一双抗性状的棉花与单抗虫棉的抗虫效果。结果表明,抗虫又抗除草剂棉花对草甘膦有较好的耐受性,四叶期喷施草甘膦后抗虫抗除草剂棉花可以安全生长,蕾期喷施草甘膦对棉花的开花率和结铃率有影响。抗虫又抗除草剂棉花和单抗虫棉对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)均具有较好的防治效果,苗期棉花叶片对棉铃虫防治效果最好,后期防治效果下降到49.2%和46.6%,吐絮期防治效果又上升到57.0%和53.1%。