快速生长转基因鲤鱼可望在中国实现商品化

由中国科学院院士、中国科学院水生生物所朱作言研究员主持的“快速生长转基因鲤鱼的中试研究”已通过成果鉴定。中国科学院李振声院士、中国工程院刘筠院士和林浩然院士等专家鉴定认为,该项研究建立了快速生长转基因鲤鱼的高效、安全养殖模式;对转“全鱼”生长激素基因鱼食品消费安全进行了严密的科学实验,证实了转“全鱼”生长激素基因鱼的食品消费安全性,为转“全鱼”生长激素基因鲤鱼的大规模商品化生产提供了科学依据,研究成果居国际领先水平。 朱作言院士主持的该项研究,筛选获得了快速生长的转“全鱼”生长激素基因黄河鲤鱼核心群200尾,其生长速度比对照鱼快140％以上。试验证明：转基因鱼怀卵量略低于普通黄河鲤鱼,受精率和孵化率与对照鱼无显著差异,转“全鱼”生长激素基因黄河鲤鱼具备大规模苗种繁育生产能力;转“全鱼”生长激素基因鲤鱼F1代的大规模养殖不仅增产,而且可降低养殖成本,并为转基因鱼的进一步选育提供材料;转“全鱼”生长激素基因三倍体鱼平均体重增长速度比对照鱼提高15％,铒料利用效率提高11．1％,由此建立了转“全鱼”生长激素基因高效、安全的养殖模式。试验还证明：摄食转“全鱼”生长激素基因鱼对小鼠的生长、脏器发育、血液生理生化指标、繁殖能力及其后代的生长发育均无影响。为此,专家建议,尽快推广养殖转基因三倍体鲤鱼,在我国建立世界首例转基因动物品种商品化生产的范例。杨淑培     

两种不同终止子在转基因鲤鱼中的促生长效应

转基因构建体中启动子的选择会直接影响转植基因的活性, 近年来有研究表明转基因构建体中终止子的选择会一定程度地影响转植基因的活性。为了更好地筛选转基因构建体和培育快速生长的转“全鱼”生长激素(Growth hormone, GH)基因鱼, 文章用鲤鱼β-actin基因终止子和生长激素基因终止子分别构建了转基因构建体, 显微注射得到转“全鱼”GH基因鱼P0代养殖群体, 比较两种不同终止子构建体的活性。统计分析发现, 生长激素基因终止子构建体的养殖群体的体重频率呈正态分布且平均体重显著高于β-actin基因终止子构建体的养殖群体, β-actin基因终止子构建体的养殖群体的体重频率呈右倾趋势的非正态分布。值得一提的是在混合养殖组中得到一条生长最为快速的鲤鱼证实为转基因阳性且为生长激素基因终止子构建体的转基因鲤鱼。该结果表明转“全鱼”生长激素基因鲤鱼可快速生长, 并能将转植基因向下代遗传。实验结果提示生长激素基因终止子构建体比β-actin基因终止子构建体表现的促生长活性要强。     

外源生长激素基因在蓝太阳鱼中的整合、表达和遗传

通过基因重组, 将石斑鱼生长激素基因编码序列克隆到鲤鱼βactin基因启动子下游, 构建了“全鱼”生长激素基因表达载体pCAecGHc。采用显微注射法, 研制出转“全鱼”生长激素基因蓝太阳鱼。经过PCR、PCR Southern杂交、RT PCR等技术对转植基因在转基因蓝太阳鱼中的整合和表达情况进行了检测。结果表明:转植基因在两批次P0 转基因蓝太阳鱼中的整合率为5 .60%和12. 26%, 并在转基因鱼中得到了正确表达, 表现为嵌合性表达。对转基因蓝太阳实验鱼进行了对照养殖实验, 初步显示转基因蓝太阳鱼具有较快的生长表型效应, 比对照组生长速度快20%-40%左右。应用近交策略培育出了两个转基因蓝太阳鱼F1 品系, 检测表明, 转植基因在两个品系的整合率分别为22 .03%和40 .8%。结果表明: 转植基因通过性腺传递给了子代, 同时也证实转基因P0 代的生殖腺为转植基因的嵌合体。     

转基因鱼离市场还有多远

根据本实验室转基因鱼育种研究的现状,讨论了“转基因鱼离市场还有多远”这一令人关注的问题。转草鱼生长激素重组基因（ＣＡｇｃＧＨ）鲤鱼具有明显的快速生长和饵料节省效应,鱼体有高干物质含量及高蛋白低脂肪的生化组成,是一种优质食用鱼。把一种鱼的基因转移到另一种鱼,即转“全鱼”基因后,受体鱼基因组改变的程度,仅相当于两种杂交的１０万分之一左右,因而它对水生态系统的胁迫作用轻微的,充其量可视为与相应杂交鱼实质     

全鱼基因的构建及其在鲫鱼体内的整合与转录

利用PCR技术删除大麻哈鱼生长激素基因的启动序列,通过基因重组构建出全鱼基因（鲤鱼MT启动子－大麻哈鱼生长激素基因）;以融合全鱼基因为外源基因,通过显微注射方法将其线性片段导入鲫鱼受精卵内,研究其整合与转录效率。结果表明,全鱼基因在鲫鱼基因组中的整合率为36．4％（16／44）,对转基因阳性鱼的RNA样本进行Northern印迹杂交检测,转录率为25％（1／4）。因此,该全鱼基因可以作为转基因鱼研究和应用的外源基因。     

人生长激素和转移的人生长激素基因对去垂体鱼的生长代偿效应

通过显微注射技术,将小鼠重金属螯合蛋白(MT-1)基因启动顺序与人生长激素基因顺序的重组体pMThGH注入鲤鱼(Cyprinus carpio)的受精卵内,由此发育的转基因鱼及其后代F1和F2均显示出快速生长效应。去垂体后,转基因鲤鱼F2持续生长,而非转基因鲤鱼和鲫鱼(Carassius auratus)的生长停止。给去垂体的鲫鱼腹腔注射生物合成的人生长激素(hGH),可恢复其生长。实验结果表明,转基因鱼体内表达和体外生物合成的hGH均能代偿鲤鱼和鲫鱼的内源生长激素并刺激去垂体鱼的生长。     

转基因鱼的研究进展与商业化前景

转基因技术为鱼类育种开辟了新的途径。目前已培育出转生长激素基因鲤、鲑和罗非鱼,转荧光蛋白基因斑马鱼与唐鱼等可稳定遗传的转基因鱼品系,其中快长转生长激素基因鱼的获得对于提高水产养殖的产量与养殖效益具有十分重要的意义。文章简要综述了转基因鱼应用研究的成就、相关技术及生态安全方面的研究进展。显微注射仍是目前基因转植的常用方法,应用转座酶或巨核酸酶介导的转基因新技术可提高基因转植效率与整合率。转基因元件的选择应尽量考虑"全鱼"基因或"自源"基因,以减少转基因鱼食用安全方面的顾虑同时也有利于转植基因的表达与生理功效的发挥。生态安全是转基因鱼商用化面临的最大问题。虽然有研究显示转基因鱼与传统的选育鱼类相比适合度较差,但由于环境与基因型间的相互作用,根据实验室获得的转基因鱼对生态影响的结果,难以预测转基因鱼一旦逃逸会对自然水生态环境产生怎样的影响。因此应建立高度自然化的环境以获得可靠的数据客观评价生态风险,有效的物理拦截、不育化处理等生物学控制策略仍是保证转基因鱼安全应用的关键措施。     

Studies on Pattern of Producing Transgenic Fish I.Production and Detection of All fish TRansgenic Common Carp With cMT sGH Gene

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一项重要研究就是利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件;二是外源基因的高整和率与高表达。已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射,将鲤鱼金属硫蛋白启动子（ｃＭＴ）与大马哈鱼生长激素基因（ｓＧＨ）的融合基因（ｃＭＴｓＧＨ）导入鲤鱼单细胞后期的早期胚胎,构建了全鱼转基因鲤鱼。通过斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结合ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,对外源ｓＧＨ的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼,收集卵子和精子,湿法受精获得受精卵。经过基因注射,孵化后的鱼苗放入水族箱。待鱼苗平游,提取总ＤＮＡ进行检测。以ＰｓｔＩ酶切质粒ｐｃＭＴｃＧＨ（Ｆｉｇ．４）分离３．４ＫｂｓＧＨ片段,用随机引物标记,作为杂交探针。同时,设计并合成ｓＧＨ基因的ＰＣＲ特异引物。Ｆｉｇ．１的斑点杂交结果与Ｆｉｇ．２的ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ结果相比较（Ｔａｂｌｅ１）,说明斑点杂交存在着高的假阳性。而ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ将ＰＣＲ的快速、方便与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ的准确性相结合,排除了Ｐ     

鱼类基因转移育种的几个问题

１９８５年,世界上第一批转基因鱼诞生。随后,鱼类基因转移迅速应用到培育高产、优质和抗逆的养殖鱼类新品种,并在解决发育生物学分子生物学和生理学等方面的难题中发挥了重要作用。目前,研究者已经建立了三种成熟的鱼类基因转移方法,即显微注射、电脉冲和精子携带法,证实了转移大受体鱼基因组中的整合、性腺传递、表达和转译表达产物的生物活性。最近,“全鱼”生长激素（ＧＨ）基因的克隆与应用,使快速生长转ＧＨ基因鱼的研     

国家自然科学基金委员会生命科学部2001年度资助重点科学基金项目一览表(26项)

项 目 名 称 申请者姓名 单 位 名 称野油菜黄单胞菌致病性的功能基因组学 唐纪良 广西大学低毒病毒的宿主因子基因和靶基因的克隆及其功能研究 陈保善 广西大学被子植物基部类群的结构、分化和系统学关系 路安民 中国科学院植物研究所现生六足动物高级阶元系统演化与分类地位的研究 尹文英 中国科学院上海昆虫研究所转“全鱼”生长激素基因鲤鱼的生态安全研究 汪亚平 中国科学院水生生物研究所受损常绿阔叶林生态系统退化机制的研究 宋永昌 华东师范大学朊蛋白（ＰｒＰ）糖基化和糖脂化修饰及其生物学功能的研究 董小平 中国预防医学科学院…     

荧光异彩观赏鱼

历史回眸1985年,我国科学家朱作言先生通过显微注射方法,将人的生长激素基因和小鼠重金属螯合蛋白启动子相结合,注入鲫鱼受精卵,成功构建了世界上首例转基因鱼,掀起了世界各国对转基因鱼的研究热潮。此后,转基因鱼研究有了长足     

饥饿状态下转基因鲤鱼和对照鲤鱼血清生长激素的表达研究

研究采用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)技术,比较分析了转GH基因鲤鱼和对照鲤鱼在饥饿和饱食状态下血清生长激素水平的变化规律,并探讨其可能机制.实验结果表明,在投喂实验中,转基因鲤鱼和对照鲤鱼血清生长激素水平均无明显变化,但转基因鲤鱼血清生长激素远高于对照鲤鱼,分别为(142.0±4.9)ng/mL和(1.6±0.2)ng/mL,转基因鲤鱼体重增长速率显著高于对照鱼.在饥饿实验中,转基因鲤鱼的血清生长激素迅速下降,从(142.0±4.9)ng/mL降至(46.0±3.2)ng/mL,而后稳定在这一较低水平;对照鲤鱼血清生长激素持续卜升,从(1.6±0.2)ng/mL升至(10.9±1.4)ng/mL,体重负增长速率没有显著差异.研究结果提示,转GH基因鲤鱼血清生长激素的调控机制与对照鲤鱼的不同,其表达水平不受脑垂体反馈抑制调控机制的影响,而与重组GH基因中β-actin基因启动子的调控模式相关.     

转基因鱼构建模式的研究 I．cMT—sGH全鱼基因鱼的构建与检测

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一顶重要研究利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件;二是外源基因的高整和率与高表达,已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射,将鲤鱼金属硫蛋白启动子（cMT）与大巴哈鱼生长激素基因（sGH）的融合基因（cMT-sGH)导入鲤鱼半日细胞后期的早期胚胎,构建了全鱼基因鲤鱼。通过斑点杂交、Southern blot结合PCR－Southern blot,对外源sGH的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼,收集卵子和精子,湿法受精获得受精卵。经过转基因注射,孵化后的鱼苗放入水族。待鱼平游,提取总DNA进行检测。以PstI酶切质粒pcMTsGH(Fig.4)分离3．4KbsGH片段,用随机引物标记,作为杂交探针。同时,设计并合成sGH基因的PCR特异引物。Fig.1的斑点杂交结果与Fig.2的PCR－Southern结果相比较（Table1),说明斑眯杂交存在着高的假阳性。而PCR－Southen将PCR的快速、方便与Southern的准确性相结合,排除了PCR本身可能的非特异,大大提高了检测效率,同时也检验了引物的设计是否成功。Table1的结果表明：我们所构建的基因鱼达到了37．7％的高整和率,且稳定性好。高整和率的原因与所使用的基因元件有很大关系。Fig.3基因组的Southern行为－PstI和BglII酶切的杂交信号条带多、共迁移,说明基因的整和方式为多拷贝,可能伴有碱基修饰。这可能是表达率降低的重要原因。     

转青鱼生长激素基因异源四倍体鲫鲤

生态安全性是转基因鱼走向市场的瓶颈,通过转基因四倍体鱼同转基因二倍体鱼杂交获得不育的转基因三倍体鱼是解决该问题的有效途径之一.本研究构建了青鱼β-actin基因启动子和青鱼生长激素（GH）基因精确连接的＂全鱼＂基因pbcAbcGHc;并采用显微注射法将pbcAbcGHc导入异源四倍体鲫鲤受精卵.对照养殖结果表明,150日龄的转基因异源四倍体鲫鲤原代（P0）的体重及体长明显大于对照组.选择60尾P0代转基因异源四倍体鲫鲤,采用PCR方法检测出外源青鱼GH基因在P0代转基因四倍体尾鳍基因组DNA中的整合率为90%;对20尾雄性P0代转基因四倍体精液样本的PCR检测发现,13个样本具有外源青鱼GH基因的整合.在一尾生长速度显著的P0代转基因四倍体鲫鲤的肌肉、肝脏、肾脏和卵巢组织中可检测到外源青鱼GH基因的转录.本研究成功获得了具有明显生长优势的P0代转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤,为建立转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤纯系和研制不育的转基因三倍体鱼奠定了基础.     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是钱定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹鳟鱼生长激素cDNA上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快20％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（F.1,插入0．8Kb,位于XbaI和PstI之间)的表达质粒（Fig.2,命名为pCMV－TK－CGH）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,注射了1000粒卵,获得了转基因实验鲫鱼480尾。孵化率为48％。将其中100尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的50尾进行PCR检测。其中8条鱼的基因组DNA有0．6Kb的PCR扩增产物（Fig.3),表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为16％。其中最大的一条体重4．2g,体和6cm,比对照（0．7g,4cm）体重增加5倍,体长增加2cm(Fig.4)。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和人单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（属强启动子）,对鲤鱼生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因的同源性,对转基因鲫鱼的PCR检测参照了加拿大学者Du所用引物的设计、使注射的外源基因与其本身的内源生长激素基因相区别。我们的转基因整合率（16％）与Zhang(10%)、Grass和Hackett等报道的接近。转基因鲫鱼生长速度增加的倍数（5倍）与Du等人的结果（2－6）接近。但是,这一生长速度快的优势能否遗传给后代,有待进一步观察。     

人生长激素基因在转基因鲤鱼体内的遗传

通过有性繁殖转移入生长激素基因鲤鱼(P₁),获得了转基因鲤鱼的子一代(F₁)和子二代(F₂);外源基因在转基因P1与普通鲤鱼杂交产生的F₁代和转基因F1代自交产生的F₂代鱼中的存在率分别为45．4％和66．7％,外源基因拷贝数在子代个体之间存在很大差异,从每细胞2拷贝到每细胞200拷贝不等;外源基因在转基因鱼子代中仍可表达具有生物功能的产物．人生长激素(h1GH),并能促进鱼的生长。     

生长激素及其基因转移对鱼类生长和渗透压的调节作用

生长激素及其基因转移对鱼类生长和渗透压的调节起着重要作用。转生长激素基因鱼表现出明显的快速生长效应。生长激素促进了鲑科鱼类对海水的适应能力。本文对此进行了综述,并讨论了生长激素及其基因转移对鱼类生长和渗透压调节作用的生理机制、生长激素与胰岛素样生长因子以及甲状腺激素的关系。     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是鱼类定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹蹲鱼生长激素ｃＤＮＡ上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快２０％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（Ｆｉｇ．１,插入片段为０．８Ｋｂ,位于ＸｂａＩ和ＰｓｔＩ之间）的表达质粒（Ｆｉｇ．２,命名为ｐＣＭＶ－ＴＫ－ＣＧＨ）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,共注射了１０００粒卵,获得了转基因实验鲫鱼４８０尾,孵化率为４８％。将其中１００尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的５０尾进行ＰＣＲ（检测。其中８条鱼的基因组ＤＮＡ有０．６Ｋｂ的ＰＣＲ扩增产物（Ｆｉｇ．３）,表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为１６％。其中最大的一条体重４．２ｇ,体长６ｃｍ,比对照（０．７ｇ,４ｃｍ）体重增加５倍,体长增加２ｃｍ（Ｆｉｇ．４）。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和     

生长激素及其基因转移对鱼类生长和

生长激素及其基因转移对鱼类生长和渗透压的调节起着重要作用.转生长激素基因鱼表现出明显的快速生长效应.生长激素促进了鲑科鱼类对海水的适应能力.本文对此进行了综述,并讨论了生长激素及其基因转移对鱼类生长和渗透压调节作用的生理机制、生长激素与胰岛素样生长因子以及甲状腺激素的关系.     

转基因鱼生态风险评价及其对策研究进展

遗传改良的转基因鱼具有许多优良经济性状, 但转基因鱼迄今尚未进行商业化养殖, 主要原因之一在于对转基因鱼逃逸或放流到自然水体中可能产生的生态风险的担忧. 本文以具有快速生长特性的转生长激素(GH)基因鱼为对象, 分析了转基因鱼潜在生态风险的实质, 简要综述了通过单因子表型与适合度分析、数学模型推演研究转基因鱼生态风险的现状, 阐述了利用人工模拟生态系统开展转基因鱼生态风险评价的新思路及最新研究成果, 同时评述了采用三倍体途径控制转基因鱼生态风险的策略及原理; 在此基础上, 提出生态风险评价与生态风险防范策略是转基因鱼育种研究体系中不可或缺的重要组成、必须与育种研究同步进行的观点, 以期为转基因鱼育种及生态风险评价和对策研究提供启示.